廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科，廣東 湛江 524001

【Abstract】 Serious liver damage may ultimately cause liver failure. Much attention has been paid to understanding of molecular mechanisms underlying liver damage and liver regeneration. Extracellular vesicles (EVs) secreted by various types of cells were known as the carriers of information communication and can modulate target cells’ biological behaviours through contents-proteins, mRNA and miRNA. EVs deprived from stem cells can regulate the proliferation and apoptosis of hepatocytes and hepatic stellate cells (HSCs), which is great significance to liver regeneration. This article reviewed the functions of EVs deprived from stem cells to deepen our understanding of the mechanism of those EVs.

【Keywords】 Liver regeneration; Extracellular vesicles; Exosomes; Microvesicles; Stem cells

肝臟不僅是人體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝最重要的器官，也是有機(jī)體執(zhí)行生物轉(zhuǎn)化功能最大的場(chǎng)所。體內(nèi)外的眾多因素，包括基因性、代謝性、藥物性和病毒性等均可導(dǎo)致肝損傷[1-2]。一方面，急性、嚴(yán)重的肝損傷或慢性肝損傷的急性加重可導(dǎo)致肝功能衰竭、肝性腦病等，甚至短期內(nèi)死亡；另一方面，慢性持續(xù)性的肝損傷可導(dǎo)致肝纖維化，并發(fā)門(mén)靜脈高壓、上消化道大出血等，慢性乙型/丙型病毒性肝炎肝硬化和酒精性肝硬化等還可以進(jìn)一步發(fā)展為原發(fā)性肝癌，嚴(yán)重影響患者生命[3-4]。盡管肝細(xì)胞具有強(qiáng)大的再生能力，但在急性、嚴(yán)重的肝損傷時(shí)，肝細(xì)胞的再生修復(fù)能力仍不能完全維持肝功能正常[5-6]。而臨床上肝損傷最有效的治療方案仍是肝移植。限于供體肝臟來(lái)源有限及術(shù)后長(zhǎng)期的抗排斥治療，能夠接受肝移植手術(shù)的患者非常少。因此，肝損傷及其修復(fù)一直是肝臟疾病研究的前沿?zé)狳c(diǎn)問(wèn)題。

事實(shí)上，肝損傷的修復(fù)是一個(gè)極為復(fù)雜的病理生理過(guò)程，其中涉及許多細(xì)胞與分子事件，肝臟損傷后肝臟精細(xì)結(jié)構(gòu)與功能重建需要肝內(nèi)外各類(lèi)型細(xì)胞之間相互協(xié)調(diào)和嚴(yán)格調(diào)控，尤其是肝內(nèi)微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重建與維持對(duì)肝功能恢復(fù)至關(guān)重要。最近研究[7]表明：肝內(nèi)外各種細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)在細(xì)胞間通信及肝內(nèi)微環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用。EVs是一類(lèi)富含各種蛋白質(zhì)、脂類(lèi)物質(zhì)及核酸成分如DNA、RNA和microRNA等的微小囊泡[8-9]，作為細(xì)胞間的信息交流載體，肝內(nèi)外許多具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞，包括肝外干祖細(xì)胞、肝臟干細(xì)胞及特殊的肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)所產(chǎn)生的EVs通過(guò)一定的途徑進(jìn)入肝臟后可調(diào)節(jié)肝內(nèi)多種細(xì)胞包括肝細(xì)胞、HSCs、內(nèi)皮細(xì)胞的活化、增殖、凋亡、自噬及遷移等，從而影響肝再生?，F(xiàn)就該類(lèi)EVs對(duì)肝再生的調(diào)控作一概述，以便更好地了解肝損傷修復(fù)的機(jī)制及探索促進(jìn)肝再生的治療方案。

1 EVs的分類(lèi)及特征

EVs是指從細(xì)胞膜上脫落或由細(xì)胞分泌的具有雙層膜狀結(jié)構(gòu)的囊泡小體，直徑為40～1 000 nm。根據(jù)其形成過(guò)程及生物學(xué)特性EVs分為三類(lèi)：外泌體(exosomes)、細(xì)胞膜微粒/細(xì)胞微泡(microvesicles)及凋亡小體(apoptosis bodys)[10]。凋亡小體是指細(xì)胞凋亡過(guò)程中細(xì)胞萎縮、碎裂所形成的具有質(zhì)膜包裹的含核及細(xì)胞質(zhì)碎片的小體，不在本文討論范疇。

1.1外泌體外泌體是由細(xì)胞內(nèi)溶酶體顆粒內(nèi)陷形成的多泡體，通過(guò)與質(zhì)膜融合向胞外分泌的微小囊泡，其大小較均一，直徑為40～100 nm[11]。外泌體囊泡膜具有脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，膜表面標(biāo)記物主要有CD9和CD63，囊泡內(nèi)富含多種蛋白質(zhì)和核酸如mRNA、miRNA等，其中Alix和TSG101蛋白為其囊內(nèi)標(biāo)記物[12-14]。

1.2細(xì)胞膜微粒/細(xì)胞微泡膜微粒是由細(xì)胞通過(guò)出芽方式與細(xì)胞膜融合，直接從細(xì)胞脫落所形成的微小囊泡。膜微粒直徑較外泌體大，為50～1 000 nm[8]。膜微粒內(nèi)除了富含蛋白質(zhì)、mRNA及miRNA外，還有大量的細(xì)胞因子、趨化因子、金屬蛋白酶和磷脂酰絲氨酸等，其標(biāo)記物主要有整合素、基質(zhì)金屬蛋白酶和組織因子等[15]。

1.3EVs的作用途徑EVs內(nèi)含豐富的蛋白質(zhì)如細(xì)胞因子、趨化因子和核酸如mRNA、miRNA等，這些蛋白質(zhì)和核酸通過(guò)一定途徑進(jìn)入靶細(xì)胞后，可參與調(diào)控靶細(xì)胞的多種生命活動(dòng)，影響靶細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移及自噬等，是細(xì)胞間信息傳遞的重要載體。EVs作用于靶細(xì)胞的途徑主要有：(1)直接與靶細(xì)胞胞膜融合；(2)靶細(xì)胞通過(guò)內(nèi)吞作用攝?。?3)特異性受體介導(dǎo)[9，16-17]。

2 肝再生中具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞來(lái)源的EVs的作用

近年來(lái)，干細(xì)胞治療在組織損傷修復(fù)中展現(xiàn)出巨大的潛力。研究[18-19]表明，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有向肝細(xì)胞分化、抑制肝臟炎癥反應(yīng)、促進(jìn)肝細(xì)胞再生和分泌多種對(duì)肝臟具有保護(hù)作用的細(xì)胞因子等的作用。但干細(xì)胞移植所帶來(lái)的細(xì)胞排斥反應(yīng)、醫(yī)源性腫瘤形成和輸入性有害物質(zhì)等問(wèn)題仍沒(méi)得到有效解決。而MSCs來(lái)源的EVs相對(duì)于干細(xì)胞治療則簡(jiǎn)單很多。越來(lái)越多的研究[20-22]表明,不同組織來(lái)源的成體干細(xì)胞產(chǎn)生的EVs不僅能誘導(dǎo)干細(xì)胞沿著EVs來(lái)源的細(xì)胞系方向分化，還能誘導(dǎo)該組織的內(nèi)在修復(fù)能力。對(duì)于肝臟，干細(xì)胞來(lái)源的EVs在具有上述干細(xì)胞促進(jìn)肝再生作用同時(shí)，并沒(méi)有帶來(lái)免疫排斥反應(yīng)和新生腫瘤的問(wèn)題，在促進(jìn)肝再生應(yīng)用方面具有更大可能和潛力。

在肝臟遭受損傷時(shí)，肝內(nèi)外的許多具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞如肝外干祖細(xì)胞、肝臟干細(xì)胞和特殊HSCs等可釋放EVs包括外泌體和膜微粒，這些EVs經(jīng)過(guò)上述途徑進(jìn)入肝臟后可發(fā)揮調(diào)節(jié)肝內(nèi)細(xì)胞主要是肝細(xì)胞、HSCs和內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移等生命活動(dòng)，影響損傷肝臟的再生修復(fù)。

2.1肝外干祖細(xì)胞來(lái)源的EVs對(duì)肝再生的影響越來(lái)越多的研究[5,23-24]表明，MSCs來(lái)源的EVs具有抗炎、抗凋亡和促進(jìn)肝細(xì)胞再生的作用，可有效減輕肝損傷的炎癥反應(yīng)，改善肝細(xì)胞功能。在體外培養(yǎng)條件APAP/H2O2誘導(dǎo)的肝損傷模型中，TAN等研究表明，來(lái)源于MSCs的外泌體可通過(guò)上調(diào)肝細(xì)胞內(nèi)BCL-XL和下調(diào)Caspase-3/7的表達(dá)，抑制損傷肝細(xì)胞凋亡；他們還發(fā)現(xiàn)，在CCl4誘導(dǎo)的肝損傷模型中，該外泌體同樣具有改善肝細(xì)胞活力、促進(jìn)肝細(xì)胞增殖和抑制凋亡的作用，進(jìn)一步的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，這可能和肝組織細(xì)胞內(nèi)增殖相關(guān)蛋白PCNA和Cyclin D1的表達(dá)上調(diào)有關(guān)；而在缺血/再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，I/R injury)模型中。NONG等[23]還發(fā)現(xiàn)，MSCs來(lái)源的外泌體具有調(diào)控炎癥相關(guān)因子如腫瘤壞死因子α(TNF-α)和IL-6及高遷移率蛋白HMGB1的表達(dá)，抑制損傷肝臟的炎癥應(yīng)激反應(yīng)和肝細(xì)胞凋亡，降低轉(zhuǎn)氨酶的釋放，改善缺血再灌注損傷肝臟預(yù)后的作用。在爆發(fā)性肝衰竭動(dòng)物模型中，CHEN等[24]研究發(fā)現(xiàn)，人經(jīng)血來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(MenSCs)外泌體除了可以抑制Caspase-3誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡外，還可以減少肝組織內(nèi)單核細(xì)胞的浸潤(rùn)和肝內(nèi)炎癥的擴(kuò)散，可有效改善肝功能，提高爆發(fā)性肝衰竭生存率；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這些外泌體內(nèi)含有多種細(xì)胞因子如細(xì)胞黏附分子ICAM1、血管緊張素2、IGFBP6、IL-6和IL-8等，這些細(xì)胞因子通過(guò)內(nèi)化進(jìn)入肝細(xì)胞后可有效改善肝細(xì)胞功能和減輕肝臟的炎癥反應(yīng)。

HSCs作為人體肝臟主要構(gòu)成細(xì)胞之一，它的持續(xù)活化一直被認(rèn)為是肝纖維化發(fā)生和進(jìn)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[25]。在肝臟遭受持續(xù)性損傷時(shí)，肝細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞和HSCs自身可合成分泌大量的TGF-β1，其可通過(guò)TGF-β受體介導(dǎo)活化HSCs，活化的HSCs快速分裂增殖并產(chǎn)生大量膠原纖維，最終導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化的發(fā)生[3，26-27]。研究表明，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(HucMSCs)來(lái)源的外泌體除了具有上述改善肝細(xì)胞功能的作用外，還可有效抑制肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。在肝纖維化模型中，LI等[28]發(fā)現(xiàn)，HucMSCs所產(chǎn)生的外泌體可抑制TGF-β1/Smad信號(hào)通路介導(dǎo)的HSCs的活化，從而減少損傷肝臟HSCs的分裂增殖，減少膠原蛋白的生成，減緩肝纖維化的進(jìn)程；另外，HYUN等[29]還發(fā)現(xiàn)，該外泌體還可通過(guò)傳遞miR-125b抑制Hedgehog信號(hào)通路，抑制肝纖維化。而經(jīng)miR-122修飾的脂肪MSCs來(lái)源的外泌體，進(jìn)入到HSCs后，可調(diào)節(jié)星狀細(xì)胞內(nèi)miR-122相關(guān)靶基因如胰島素樣生長(zhǎng)因子受體(IGF1R)、Cyclin G1和羥化酶α1的表達(dá)，抑制HSCs的活化和膠原蛋白的沉積，具有抑制肝纖維化的作用[30]。

綜上所述，肝外干祖細(xì)胞來(lái)源的EVs不僅能有效抑制損傷肝組織內(nèi)炎癥的擴(kuò)散，還能通過(guò)促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，抑制凋亡，從而加快肝細(xì)胞再生。

2.2肝臟干細(xì)胞來(lái)源的EVs對(duì)肝再生的影響研究[31]表明，成體肝臟內(nèi)也存在一類(lèi)具有干細(xì)胞活性的細(xì)胞，被稱(chēng)為肝臟干細(xì)胞。人肝臟干細(xì)胞(human liver stem cells，HLSCs)是一群寄存于成人肝臟的多潛能干細(xì)胞群，體內(nèi)移植HLSCs有助于急性肝損傷小鼠的肝臟再生。HLSCs分泌的膜微粒大小類(lèi)似于骨髓MSCs來(lái)源的微粒大小，并能表達(dá)多種黏附分子，通過(guò)這些黏附分子內(nèi)化進(jìn)入靶細(xì)胞。研究[32]發(fā)現(xiàn)，肝臟干細(xì)胞分泌的微粒在體外能依賴(lài)微粒表面的α4-整合素內(nèi)化進(jìn)入肝細(xì)胞，誘導(dǎo)大鼠肝細(xì)胞增殖與凋亡抵制效應(yīng)。若阻斷α4-整合素可明顯阻止微粒滲入肝細(xì)胞。通過(guò)基因芯片與RT-PCR進(jìn)一步證明分泌的微粒能運(yùn)送與轉(zhuǎn)錄、翻譯、增殖、凋亡等相關(guān)的一組mRNA。大鼠靜脈注射30 μg肝臟干細(xì)胞分泌的微粒，可促進(jìn)70%肝切除大鼠肝臟形態(tài)與功能的恢復(fù)，該效應(yīng)與促進(jìn)肝細(xì)胞增殖密切相關(guān)。若應(yīng)用RNA酶預(yù)處理這些微粒，肝細(xì)胞生長(zhǎng)增殖與肝功能恢復(fù)立刻受阻，這些結(jié)果提示，肝臟干細(xì)胞來(lái)源的微粒在肝切除后可通過(guò)水平轉(zhuǎn)移特定的mRNA至靶細(xì)胞，激活并重啟存留肝細(xì)胞的增殖程序。COLLINO等[33]的研究還發(fā)現(xiàn)，成體肝臟干細(xì)胞來(lái)源的膜微粒含有核糖核蛋白，這種蛋白質(zhì)內(nèi)化進(jìn)入肝細(xì)胞后可參與miRNA的分選活動(dòng)，影響肝細(xì)胞內(nèi)核酸的轉(zhuǎn)錄、翻譯，影響肝細(xì)胞的分裂增殖。

目前對(duì)肝臟干細(xì)胞來(lái)源的EVs的研究主要集中在對(duì)肝細(xì)胞的影響上，肝臟干細(xì)胞來(lái)源的外泌體和膜微粒對(duì)肝內(nèi)炎癥的發(fā)展和對(duì)HSCs的活化、增殖的影響尚需進(jìn)一步探索。

2.3肝內(nèi)特殊類(lèi)型HSCs來(lái)源的EVs對(duì)肝再生的影響HSCs是人體肝臟的主要構(gòu)成細(xì)胞之一，其位于肝臟的disse間隙內(nèi)，與肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞緊密聯(lián)系，相互作用。在正常狀態(tài)下，HSCs處于靜止?fàn)顟B(tài)，合成機(jī)體所需的維生素A；當(dāng)肝臟遭受病毒感染或遭受藥物損傷時(shí)，HSCs可被肝細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞和自身所產(chǎn)生的TGF-β1等活化并轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞并合成大量的膠原纖維，參與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展。不同狀態(tài)的HSCs均可產(chǎn)生EVs，作為細(xì)胞間信息交流的載體，不同狀態(tài)的HSCs外囊泡對(duì)肝再生具有不同的調(diào)控作用。曾有研究[34-35]表明，HSCs是肝臟內(nèi)一群特殊的MSCs，其本身細(xì)胞膜和分泌的膜微粒攜帶了MSCs所具有的特異性膜表面標(biāo)記物CD105、CD44、CD29、CD13和CD90。研究[36]發(fā)現(xiàn)，該膜微粒也具有干祖細(xì)胞膜微粒所具有的促進(jìn)肝再生的能力。在體外藥物性肝損傷模型中，靜止的HSCs膜微粒具有提高肝細(xì)胞增殖活力和抗凋亡的作用，還能減少轉(zhuǎn)氨酶的釋放，對(duì)肝臟具有保護(hù)作用。研究[37]表明，不同狀態(tài)下的細(xì)胞所分泌的EVs所攜帶的內(nèi)涵物可能有所不同，我們的后期研究發(fā)現(xiàn)，使用TGF-β1活化HSCs所收集到的膜微粒具有與靜止HSCs來(lái)源的膜微粒完全相反的作用?；罨腍SCs來(lái)源的膜微?？上抡{(diào)PI3K-AKT信息通路蛋白和上調(diào)Caspase-3的表達(dá)，抑制肝細(xì)胞的增殖，促進(jìn)損傷肝細(xì)胞的凋亡，加重藥物性肝損傷。在接下來(lái)的研究中，我們會(huì)通過(guò)質(zhì)譜分析、PCR和基因測(cè)序等重點(diǎn)研究?jī)煞N不同狀態(tài)的膜微粒內(nèi)含物的不同之處，進(jìn)一步闡明HSCs與肝細(xì)胞之間的分子機(jī)制。另外，研究[38-39]表明，非活化的HSCs可以通過(guò)外泌體向鄰旁細(xì)胞轉(zhuǎn)移miRNA-214，miRNA-214可直接作用于靶細(xì)胞結(jié)締組織生長(zhǎng)因子基因CNN2的3’末端，以抑制CNN2的表達(dá)，抑制肝纖維化；而SHEN等[40]則發(fā)現(xiàn)，在肝臟受到損傷時(shí)，HSCs被激活，表達(dá)的miRNA-214會(huì)減少，分泌含miRNA-214的囊泡也減少，其對(duì)CNN2的表達(dá)抑制能力下降，最終導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生。

3 總結(jié)與展望

EVs作為細(xì)胞間信息交流的重要載體，它所攜帶的蛋白質(zhì)、mRNA和miRNA等通過(guò)一定的途徑進(jìn)入靶細(xì)胞后，可調(diào)節(jié)靶細(xì)胞的多種生物學(xué)行為。干細(xì)胞，包括肝外干祖細(xì)胞、肝臟干細(xì)胞和具有干細(xì)胞特性的HSCs所產(chǎn)生的EVs可向肝組織細(xì)胞傳遞多種細(xì)胞因子、mRNA和miRNA等，進(jìn)一步調(diào)節(jié)肝細(xì)胞和HSCs內(nèi)增殖、凋亡相關(guān)通路，最終影響肝再生。干細(xì)胞來(lái)源的EVs不僅具有促進(jìn)肝細(xì)胞增殖和抗凋亡的作用，在損傷肝臟內(nèi)其還具有抗炎作用。因此其在治療方面有著巨大的潛力，為肝臟疾病的治療提供了新思路；在肝損傷再生修復(fù)中，EVs不僅具有易制備及儲(chǔ)存、穩(wěn)定性高、定量使用等優(yōu)點(diǎn)，還可以避免干細(xì)胞治療所帶來(lái)一系列問(wèn)題如：免疫排斥、醫(yī)源性腫瘤形成和外源性毒性物質(zhì)的輸入等，是一種具有較高安全性的生物制劑。

雖然干細(xì)胞來(lái)源的EVs在肝再生和肝損傷治療方面展現(xiàn)出較好的使用前景，但其提存技術(shù)仍需進(jìn)一步的提高和動(dòng)物水平最適治療濃度仍需深入探究。另外，干細(xì)胞在不同狀態(tài)下所產(chǎn)生的EVs所含的內(nèi)含物可能也有所不同，導(dǎo)致對(duì)肝再生具有不同的影響，因此，EVs所攜帶的內(nèi)含物及其作用機(jī)理還需進(jìn)一步闡釋。

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