豬流行性腹瀉病毒變異株RT-PCR檢測(cè)方法的建立

俞正玉，逄鳳嬌，孫 冰，徐向偉，茅愛華，郭容利，范寶超，杜露平，溫立斌，倪艷秀，何孔旺，李 彬

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所/國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210014)

豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diahorrea virus，PEDV)是引起豬嘔吐、腹瀉和脫水為主要臨床癥狀特征的豬腸道傳染病病原，哺乳仔豬、架子豬或育肥豬等各年齡段均可發(fā)病，但哺乳仔豬中的感染率最高[1-2]。該病多發(fā)生在冬春寒冷季節(jié)，以12月至次年2月為高發(fā)季節(jié)[3]。

2010年冬季至2011年春季全國各地豬場(chǎng)的豬群中先后發(fā)生嚴(yán)重的傳染性腹瀉疾病，發(fā)病突然，傳播較快，流行范圍廣，流行時(shí)間長，應(yīng)用各種抗生素防治無效，發(fā)病率約80%，死亡率高達(dá)50%～85%，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失[4-5]。經(jīng)研究表明，豬流行性腹瀉病毒變異株是此次疫情的元兇。變異株與原來毒株P(guān)EDV經(jīng)典毒株CV777(AF353511.1)的基因組同源性在97%左右，變異最大的為S基因，同源性在94%以下，且存在氨基酸發(fā)生缺失和插入的序列特征。此前，我國尚無PEDV變異株的特異檢測(cè)技術(shù)，目前的常規(guī) RT-PCR 技術(shù)不能區(qū)分PEDV經(jīng)典毒株和變異株[6-8]，只能依靠序列測(cè)定和分析來確診，操作繁雜、耗時(shí)長、成本較高。因此，本試驗(yàn)根據(jù)豬流行性腹瀉病毒變異株S基因發(fā)生核苷酸缺失和插入的特征，設(shè)計(jì)并合成檢測(cè)引物，采用 RT-PCR方法擴(kuò)增PEDV變異株的部分S基因，而不與PEDV經(jīng)典毒株反應(yīng)，從而特異、敏感、省時(shí)、省力地檢測(cè)出PEDV變異株，為PEDV的檢測(cè)提供工具，對(duì)防控豬流行性腹瀉病具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 病毒株

豬流行性腹瀉病毒變異株AH2012、豬流行性腹瀉病毒經(jīng)典株CV777、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬傳染性胃腸炎(TGEV)、豬輪狀病毒(PoRV)均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所分離并保存。

1.2 主要試劑與儀器

核酸(RNA/DNA)提取試劑盒購自北京天恩澤基因科技有限公司，RT-PCR Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，dNTP、DL2000 DNA Marer、pMD18-T載體等購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)和合成

根據(jù)豬流行性腹瀉病毒變異株AH2012S基因的核苷酸序列，采用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，經(jīng)過大量篩選得到如下引物序列：正向引物(PEDV-VF)序列為5′-TTGGTGAAAACCAGGGTGTC-3′，反向引物(PEDV-VR)序列為 5′-CAACACTATGTTCACTCA-3′。

1.4 病毒核酸的提取

按照核酸(RNA/DNA)提取試劑盒說明書進(jìn)行病毒核酸的提取。

1.5 RT反應(yīng)

在20 μL反應(yīng)體系中加入4.75 μL DEPC處理水，6 μL總RNA，1 μL PEDV-VR(20 μmol/L)，1 μL dNTP(10 μmol/L)，混勻后于65 ℃保持5 min，迅速轉(zhuǎn)移到冰上驟冷5 min；然后向反應(yīng)管中加入2 μL DTT(0.1 mmol/L)、4 μL 5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液、1 μLRNA酶抑制劑(40 U/μL)、0.25 μL反轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μL)，42 ℃反應(yīng)50 min；72 ℃ 15 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶后獲得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA。

1.6 PCR擴(kuò)增

在50.0 μL的反應(yīng)體系中加入30.5 μL DEPC處理水、2.0 μL cDNA、2.0 μL PEDV-VF(20 μmol/L)、2.0 μL PEDV-VR(20 μmol/L)、5.0 μL 10×PCR緩沖液、8.0 μL dNTP(2.5 mmol/L)、0.5 μL DNA聚合酶(5 U/μL)。PCR的反應(yīng)參數(shù)為94℃ 5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5min。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并觀察結(jié)果。

1.7 特異性試驗(yàn)

以PEDV變異株、PEDV經(jīng)典毒株、PRRSV、TGEV、PRV病毒RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板。取等量的模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)做陰性對(duì)照，觀察瓊脂糖凝膠電泳情況。

1.8 敏感性試驗(yàn)

在20 μL反轉(zhuǎn)錄體系中，加1 μL連續(xù)10倍稀釋后的總RNA。按照本試驗(yàn)建立的方法，在PCR反應(yīng)體系中加入2 μL的cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，觀察瓊脂糖凝膠電泳情況。

1.9 重復(fù)性試驗(yàn)

用所建立的RT-PCR方法對(duì)6份不同的PEDV變異株陽性病料樣品分別進(jìn)行3次重復(fù)性試驗(yàn)，檢測(cè)該方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.10 臨床樣品檢測(cè)

2013年自華東多地豬場(chǎng)中采集腹瀉發(fā)病豬腸道及糞便樣品共318份，提取樣品RNA，用本研究所建立的RT-PCR方法檢測(cè)各份樣品RNA中是否含有PEDV變異株核酸。檢測(cè)中使用PEDV變異株作為陽性對(duì)照。

1.11 RT-PCR方法的可靠性檢測(cè)

將PEDV變異株陽性的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測(cè)序，序列比對(duì)后驗(yàn)證PCR的可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR結(jié)果

以豬流行性腹瀉病毒變異株提取的總RNA為模板，用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增，檢測(cè)到長度為327 bp的DNA片段。

2.2 特異性試驗(yàn)

對(duì)PEDV經(jīng)典毒株CV777、豬傳染性胃腸炎(TGEV)、豬輪狀病毒(PoRV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)進(jìn)行特異性檢測(cè)，僅PEDV變異株中可檢測(cè)出長度為327 bp的DNA片段，PEDV經(jīng)典毒株及其他可能引起豬腹瀉的病毒和健康豬材料中均未檢測(cè)出(圖1)。

2.3 敏感性試驗(yàn)

將提取的陽性RNA以10倍系列稀釋，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR，結(jié)果(圖2)表明，RT-PCR最低可檢測(cè)出10-3ng/μL的PEDV樣品。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

PEDV 變異株的6次PCR擴(kuò)增的條帶大小均約 330 bp，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.5 臨床樣品檢測(cè)

對(duì)我國華東地區(qū)采集的318份臨床腹瀉發(fā)病豬的樣品進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，其中PEDV變異株陽性共有109份，陽性率為34.3%。結(jié)果表明，近年華東地區(qū)豬腹瀉病發(fā)病中，PEDV變異株的感染率較高，應(yīng)當(dāng)引起足夠重視。

2.6 RT-PCR方法的可靠性檢測(cè)

將臨床上檢測(cè)的PEDV變異株陽性10份PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測(cè)序，經(jīng)過序列測(cè)定后發(fā)現(xiàn)所測(cè)序列與PEDV變異株AH2012株的同源性在99.5%以上，證實(shí)所建立的RT-PCR方法確實(shí)能夠檢測(cè)PEDV變異毒株。

3 討論

PEDV屬冠狀病毒，主要破壞小腸茸毛，從而減小營養(yǎng)吸收的面積，并導(dǎo)致體液流失，引起脫水[1-2]。正常情況下，易感豬群遭病毒侵入2～3周內(nèi)即可產(chǎn)生很強(qiáng)的免疫，病毒就會(huì)從豬群消失[1-2]。易感豬群初次接觸病原時(shí)會(huì)爆發(fā)急性腹瀉，這種情況下各種豬群的發(fā)病率可達(dá)100%，有的表現(xiàn)為輕微的腹瀉，有的則呈現(xiàn)水樣下痢，哺乳仔豬尤為嚴(yán)重。在規(guī)?；i場(chǎng)當(dāng)中，母豬群會(huì)存在反復(fù)性的感染，而沒有母源抗體保護(hù)的仔豬會(huì)出現(xiàn)散發(fā)的臨床癥狀。母豬具體表現(xiàn)為腹瀉，可能有較微的牛糞樣稀糞，也可能呈水樣下??；仔豬主要表現(xiàn)為腹瀉、脫水，死亡率可能會(huì)很高，尤其是<10日齡的哺乳仔豬最為嚴(yán)重；斷奶豬與生長豬主要癥狀為急性水樣下痢，發(fā)病率可能很高，但死亡率通常較低[9]。

PEDV是目前臨床上豬病毒性腹瀉的主要病原[10]，而PEDV變異株是2010年我國爆發(fā)的大規(guī)模豬群腹瀉疫情的主要毒株，其與PEDV經(jīng)典毒株的同源性較高，且由于豬病毒性腹瀉與豬傳染性胃腸炎(transmissible gastroenteritis，TGE)在流行病學(xué)、臨床癥狀、病理剖檢等變化上非常相似，在快速診斷方面有一定的困難，尚需結(jié)合試驗(yàn)室診斷方法進(jìn)行確診。目前，主要的實(shí)驗(yàn)室診斷方法有免疫電鏡法(IEM)、免疫熒光法(IF)、微量血清中和試驗(yàn)、ELISA法、RT-PCR法等[9，11]。而RT-PCR 方法是目前診斷PEDV 最敏感、特異的方法[9，11]。

本試驗(yàn)中，根據(jù)變異株AH2012等S基因發(fā)生缺失和插入的序列特征，設(shè)計(jì)合成引物。以樣品總RNA為模板，利用核苷酸序列為SEQ ID NO.2的引物PEDV-VR進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RT)合成cDNA。以合成的cDNA為模板，利用核苷酸序列為SEQ ID NO.1的引物PEDV-VF和核苷酸序列為SEQ ID NO.2的引物PEDV-VR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)特異性擴(kuò)增DNA片段的位置判定豬流行性腹瀉病毒變異株的存在。該RT-PCR方法解決了目前其他PCR方法不能解決的問題，從而特異、敏感、省時(shí)、省力、低成本地檢測(cè)出豬流行性腹瀉病毒變異株。因此，該技術(shù)可對(duì)豬流行性腹瀉病毒變異株的診斷和監(jiān)測(cè)起到重要作用。本試驗(yàn)中使用該RT-PCR方法對(duì)華東地區(qū)318份臨床腹瀉發(fā)病豬病料進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中109份為PEDV變異株陽性，陽性率達(dá)34.3%，可見今年我國豬群腹瀉發(fā)病的病因中，PEDV變異株的感染仍是值得關(guān)注的問題。

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