陜西佛坪木蹄層孔菌的揮發(fā)性成分及生物活性

解修超，羅 強(qiáng)，路宏朝，陳文強(qiáng)，鄧百萬(wàn)

(1.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中 723001；2.陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心，陜西漢中 723001)

木蹄層孔菌(Fomesfomentarius)別稱火絨層孔菌，為擔(dān)子菌門(Basidiomycete)傘菌綱(Agaricomycetes)多孔菌目(Polyporales)多孔菌科(Polyaceae)層孔菌屬(Fomes)真菌，是世界性分布的木腐性真菌。在18、19世紀(jì)，曾被用來(lái)作為止血的膏藥，在傳統(tǒng)的藥典中被用來(lái)與針灸搭配治療疾??；其藥用部位為子實(shí)體，粗提物具有抗腫瘤、抗氧化、利尿、退燒、消積化、消炎止痛等作用，已經(jīng)被應(yīng)用于傳統(tǒng)藥物的生產(chǎn)。

近年來(lái)，陸勇芹等研究發(fā)現(xiàn)，木蹄層孔菌乙醇提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞具有很強(qiáng)的抑制作用[1-2]。研究表明，不同提取方法所獲得的提取物組分具有部分差異，其中報(bào)道過(guò)的化學(xué)成分包括有機(jī)酸、多糖、內(nèi)酯、苷類、植物甾醇和萜類化合物等[3]。劉量等用乙醇提取木蹄層孔菌子實(shí)體所得的提取物對(duì)S180腹腔積液瘤、人肺癌細(xì)胞NCI-H 460和人胃癌細(xì)胞SGC-7901均有較明顯的抑制效果[2，4]。陸勇芹等用石油醚等提取木蹄層孔菌所得的提取物對(duì)Hela、H22荷瘤、人肺癌(NCI-H 460)和胃腺癌(SGC-7901)等細(xì)胞株均具有較強(qiáng)的抑制效果[1，3，5]。高慧靈等研究木蹄層孔菌中多糖對(duì)小鼠免疫功能的影響，結(jié)果表明，木蹄多糖可促進(jìn)小鼠免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，增強(qiáng)小鼠的體液免疫功能及巨噬細(xì)胞的吞噬功能[6-7]。

本研究以陜西佛坪木蹄層孔菌為材料，通過(guò)索氏提取及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometer，簡(jiǎn)稱GC-MS)技術(shù)，分析子實(shí)體中揮發(fā)性物質(zhì)的化學(xué)成分，并對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)的抑菌和抗腫瘤活性進(jìn)行研究，以期為陜西佛坪木蹄層孔菌資源的開發(fā)與利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 木蹄層孔菌 木蹄層孔菌子實(shí)體樣品(圖1)采自陜西佛坪自然保護(hù)區(qū)，該自然保護(hù)區(qū)位于秦嶺中段南坡(33°43′40″N，107°46′05″E)。

1.1.2 靶標(biāo)菌株和腫瘤細(xì)胞株 大腸埃希菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)由陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心提供；肺癌腫瘤細(xì)胞株A549，由陜西理工大學(xué)維生素D生理與應(yīng)用研究所提供。

1.1.3 儀器與試劑 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GS6890N/MSD5973N型，美國(guó)安捷倫科技有限公司)，高級(jí)研究顯微鏡(E600型，日本Nikon公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo3110型，美國(guó)Thermo公司)，酶標(biāo)分析儀(TECAN infinite 200 PRO型，瑞士TECAN公司)，倒置生物顯微鏡[徠卡DMIL/DFC450，德國(guó)徠卡(Leica)公司]，數(shù)顯式恒溫培養(yǎng)箱(LRH-250-GS 型，廣東省醫(yī)療器械廠)；所用抗生素(青霉素和氯霉素)購(gòu)自美國(guó)MP Biomedicals公司，分析純?cè)噭?乙醚，二甲基亞砜等)購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，培養(yǎng)基所需試劑購(gòu)自陜西西安熱默爾生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 揮發(fā)性成分提取 將木蹄層孔菌子實(shí)體置于40 ℃烘箱中恒溫干燥48 h，干燥至恒質(zhì)量，粉碎過(guò)40目篩備用。稱取樣品40.0 g，用濾紙包裹后置于索氏提取器中，加入 300 mL 乙醚，加熱至40 ℃恒溫，回流提取 8 h，相同溫度回收乙醚，得揮發(fā)油樣品。

1.2.2 GC-MS檢測(cè) 采用氫氧化鉀-甲醇酯化法對(duì)樣品進(jìn)行處理，得到GC-MS檢測(cè)用樣[3，8]。GC-MS的檢測(cè)條件：美國(guó)J & W HP-5彈性石英毛細(xì)管柱(0.25 mm×30 m，0.25 μm)，程序升溫(以5 ℃/min的速率由50 ℃升至 240 ℃，恒溫保持2 min，進(jìn)樣口溫度200 ℃)，GC氣化室溫度為 250 ℃，載氣為99.99%高純度氦氣，流速為2.0 mL/min。質(zhì)譜條件：離子源為電子電離源(electron ionization，簡(jiǎn)稱EI)，電子轟擊能量70 eV，離子源溫度230 ℃。倍增電壓 1.28 kV，質(zhì)量掃描范圍為m/z10～550，掃描速度3.8次/s[9-10]。檢測(cè)結(jié)果在美國(guó)NIST11.lib 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)檢索確認(rèn)其成分，得到總離子流圖，運(yùn)用峰面積歸一化法并借助G170LBA化學(xué)工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)處理數(shù)據(jù)。

1.2.3 生物活性檢測(cè)

1.2.3.1 抑菌活性檢測(cè) 采用濾紙片擴(kuò)散法[10]測(cè)定樣品對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞菌的抑制作用。取適量揮發(fā)性物質(zhì)原液，分別配制成質(zhì)量濃度為200.0、100.0、50.0 g/L的樣品溶液，分別加入適量過(guò)氧化氫酶消除可能帶來(lái)的活性影響。將直徑為6.0 mm的無(wú)菌濾紙片置于各濃度樣品上清液中浸濕，貼在涂有30.0 μL靶標(biāo)菌懸液(菌懸液密度為0.8×106～1.2×106CFU/mL)的LB培養(yǎng)基平板上，對(duì)照組分別為無(wú)菌水、1%苯扎溴銨溶液、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，簡(jiǎn)稱DMSO)、青霉素和氯霉素，37 ℃ 恒溫培養(yǎng)24 h后，觀察并采用十字交叉測(cè)量法記錄抑菌圈直徑，測(cè)量各質(zhì)量濃度樣品在不同靶標(biāo)菌平板上的抑菌圈直徑。處理平行組、對(duì)照組分別設(shè)5個(gè)重復(fù)。

1.2.3.2 抗腫瘤活性檢測(cè) 采用CCK-8法[11]測(cè)定樣品的抗腫瘤活性。取對(duì)數(shù)期肺癌腫瘤細(xì)胞株A549，經(jīng)過(guò)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后使細(xì)胞液密度達(dá)到5×104個(gè)/mL，然后接入96孔板中，每孔接100 μL (腫瘤細(xì)胞數(shù)約5 000個(gè)/孔)，取相應(yīng)質(zhì)量組分揮發(fā)油樣品用濾頭過(guò)濾除菌，分別溶于適量二甲基亞砜中(最終DMSO的質(zhì)量分?jǐn)?shù)<1%)[12]，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基充分稀釋溶解藥物，作為試驗(yàn)組樣品。37 ℃培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁，試驗(yàn)組每孔各加入含相應(yīng)質(zhì)量濃度揮發(fā)性物質(zhì)的培養(yǎng)液200.0 μL，5孔重復(fù)，樣品揮發(fā)油設(shè)5個(gè)倍比質(zhì)量濃度梯度，分別為32.0、64.0、128.0、256.0、512.0 mg/L，以含1% DMSO的等量培養(yǎng)基作空白對(duì)照，其他操作步驟均與試驗(yàn)組相同。37℃繼續(xù)培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24、48 h時(shí)置于顯微鏡下觀察肺癌腫瘤細(xì)胞株A549的生長(zhǎng)情況。48 h 后向每孔中加入CCK-8試劑10.0 μL，繼續(xù)同溫培養(yǎng)1～8 h，用酶標(biāo)分析儀檢測(cè)加入CCK-8試劑后1、2、4、8 h各孔在 450 nm 處的吸光度。按以下公式計(jì)算各濃度揮發(fā)油對(duì)腫瘤細(xì)胞株A549的抑制率：腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(1-試驗(yàn)組D450 nm/空白對(duì)照組D450 nm)×100%。

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行曲線擬合，最終得半數(shù)抑制率所需揮發(fā)油質(zhì)量濃度IC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)性成分的提取

取樣品40.00 g，以乙醚作為溶劑，采用索氏提取法回流提取12 h，得到具有特殊香味的紅褐色透明狀揮發(fā)油 2.33 g，經(jīng)計(jì)算得率為5.83%。

2.2 揮發(fā)性成分的化學(xué)組成與分析

對(duì)木蹄層孔菌的揮發(fā)性成分進(jìn)行GC-MS檢測(cè)，得樣品中揮發(fā)性成分的相對(duì)含量，結(jié)果如表1所示。由表1可知，經(jīng)多重比對(duì)共檢測(cè)出7種主要化學(xué)成分，占總揮發(fā)性成分的99.99%，主要成分為酞酸二乙酯(37.82%)、十八烷醛(32.83%)、壬醛(11.98%)、9(11)-脫氫麥角酰苯甲酸酯(9.87%)，此4種成分占總檢測(cè)揮發(fā)油成分的92.50%。

表1 木蹄層孔菌揮發(fā)性成分的化學(xué)組成與含量

2.3 木蹄層孔菌揮發(fā)性成分的生物活性

2.3.1 抑菌活性 以4種細(xì)菌作為靶標(biāo)菌，對(duì)揮發(fā)性成分進(jìn)行抑菌活性研究。試驗(yàn)結(jié)果(表2)表明，各質(zhì)量濃度揮發(fā)油表現(xiàn)出不同程度的抑菌活性。由表2可知，木蹄層孔菌揮發(fā)油對(duì)4種靶標(biāo)細(xì)菌抑制活性均較弱，不同質(zhì)量濃度的抑菌效果具有一定劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系。其中揮發(fā)油質(zhì)量濃度為200.0 g/L時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑達(dá)10.27 mm，對(duì)大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌表現(xiàn)較弱的抑制活性。

2.3.2 抗腫瘤活性 將加入相應(yīng)質(zhì)量濃度揮發(fā)油的腫瘤細(xì)胞置于37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24、48 h 時(shí)觀察腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，結(jié)果如圖2至圖5所示。由圖2至圖5可知，試驗(yàn)組在培養(yǎng)24 h后，腫瘤細(xì)胞數(shù)量與同期空白對(duì)照相比明顯減少，形態(tài)相對(duì)皺縮，部分細(xì)胞裂解；48 h時(shí)相對(duì)數(shù)量繼續(xù)減少，大部分細(xì)胞出現(xiàn)裂解現(xiàn)象；空白對(duì)照組中的腫瘤細(xì)胞在48 h內(nèi)數(shù)量持續(xù)增加，形態(tài)近橢圓狀，貼壁生長(zhǎng)，易聚集成群。經(jīng)顯微觀察，試驗(yàn)組與對(duì)照組的5孔平行重復(fù)同一時(shí)期未見明顯差異。

表2 木蹄層孔菌揮發(fā)性成分對(duì)4種靶標(biāo)菌的抑菌情況

注：表中數(shù)據(jù)為5個(gè)平行組的平均數(shù)值；濾紙片直徑為 6.00 mm；0為未產(chǎn)生抑菌圈；1 000單位/mg青霉素用無(wú)菌水稀釋，1 000 單位/mg氯霉素用DMSO稀釋，濃度均為25.0 mg/mL。

通過(guò)CCK-8法測(cè)定不同濃度揮發(fā)油對(duì)肺癌腫瘤細(xì)胞株A549的抗腫瘤活性，在 450 nm處測(cè)量樣品的吸光度。試驗(yàn)結(jié)果(圖6)表明，提取物對(duì)肺癌腫瘤細(xì)胞株A549的抑制率與樣品濃度之間呈劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系，對(duì)照組加入CCK-8試劑4 h后的吸光度為2.683。

由圖6可知，木蹄層孔菌揮發(fā)性成分可明顯抑制肺癌腫瘤細(xì)胞株A549的生長(zhǎng)，并且隨著樣品濃度升高，對(duì)肺癌腫瘤細(xì)胞株A549的抑制效應(yīng)升高，抑制率最高達(dá)76.73%。其中隨著添加量倍比的增高，抑制效應(yīng)的相應(yīng)強(qiáng)度明顯上升，較高濃度時(shí)抑制率的增長(zhǎng)逐漸變緩。由揮發(fā)油濃度與肺癌腫瘤細(xì)胞株A549抑制率之間的量效關(guān)系生成的對(duì)數(shù)擬合曲線計(jì)算得到IC50=268.675 mg/L。

3 討論

本研究利用GC-MS技術(shù)分析并檢測(cè)陜西佛坪木蹄層孔菌中7種揮發(fā)性成分，結(jié)果顯示，主要為酯類和醛類，并且7種有效成分的總含量占總揮發(fā)性成分的99.99%，其中含量超過(guò)2.00%的化學(xué)成分有5種，占全部鑒定成分的96.50%，且大部分揮發(fā)性成分在其他研究中尚見未報(bào)道，如杜德堯等用石油醚、乙醇、甲醇和三氯甲烷等提取試劑時(shí)[3，5]，均未獲得本研究所檢測(cè)到的部分有效成分，并且酞酸二乙酯、壬醛、9(11)-脫氫麥角酰苯甲酸酯在木蹄層孔菌成分分析中屬首次獲得。筆者分析這可能與木蹄層孔菌寄生樹種、生長(zhǎng)條件和提取試劑等有關(guān)。

筆者對(duì)陜西佛坪木蹄層孔菌的揮發(fā)性成分進(jìn)行抑菌及抗腫瘤活性研究。試驗(yàn)結(jié)果表明，揮發(fā)油樣品對(duì)供試4種靶標(biāo)菌中的大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌抑制活性較弱，對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果較強(qiáng)。在抗腫瘤活性檢測(cè)中，樣品對(duì)肺癌腫瘤細(xì)胞株A549顯示較高的抗腫瘤活性。經(jīng)細(xì)胞形態(tài)跟蹤觀察發(fā)現(xiàn)，48 h內(nèi)揮發(fā)油對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用表現(xiàn)穩(wěn)定并持續(xù)增加；另外，隨著樣品濃度的倍比增加，腫瘤細(xì)胞的抑制率與樣品濃度之間呈劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系，IC50為 268.675 mg/L。 本研究采用 CCK-8 法進(jìn)行細(xì)胞增殖檢驗(yàn)，避免使用準(zhǔn)確度不高、易出現(xiàn)假陽(yáng)性和步驟繁瑣等缺點(diǎn)的MTT法，同時(shí)，萬(wàn)文婷等報(bào)道CCK-8法檢驗(yàn)細(xì)胞增殖效果較MTT法更佳[13]。因此，排除了部分假陽(yáng)性的干擾，使研究結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。木蹄層孔菌的揮發(fā)性成分主要為酯類和醛類等，有較好的抗腫瘤活性和一定的抑菌活性，可為陜西佛坪木蹄層孔菌資源的開發(fā)與綜合利用提供一定的理論指導(dǎo)，而關(guān)于本研究揮發(fā)油中的抑菌有效成分、最低拮抗?jié)舛燃耙志鷻C(jī)制還有待進(jìn)一步探究。

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