黃芪藥渣中多糖的酶法制備及其抗氧化活性

龍良鯤，寒子純，林群英，秦秀雯，趙浩源，丁少軍

(1.南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，江蘇南京 210037；2.南京野生植物綜合利用研究院，江蘇南京 210042)

黃芪屬豆科植物，分為蒙古黃芪[Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao]和膜莢黃芪[Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.]，以干燥根入藥[1]。黃芪的主要藥用成分為黃芪多糖、黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃酮等[2]。黃芪多糖(Astragaluspolysaccharides，APS)可作為免疫增強(qiáng)劑或調(diào)節(jié)劑，促進(jìn)抗體形成，同時還有抗病毒、抗腫瘤、抗衰老、抗應(yīng)激、抗氧化和降脂等功效[3-5]。工業(yè)上多采用水提醇沉法提取黃芪多糖，其工藝簡單易操作，但提取率較低(在3.80%～9.78%之間)[6-8]。黃芪經(jīng)水提法制備多糖后形成的藥渣中仍含有多糖等活性物質(zhì)，這些物質(zhì)被纖維素等聚合物限制而不易溶出[9-10]。纖維素酶是可降解纖維素高聚物的一組酶系，在制備多糖等藥用活性物質(zhì)方面具有良好的應(yīng)用前景[8，11]。本試驗利用纖維素酶制備黃芪藥渣中的多糖，通過單因素和正交試驗優(yōu)化酶解作用條件，并評價黃芪多糖的抗氧化活性，為進(jìn)一步高效利用黃芪資源提供技術(shù)途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黃芪，產(chǎn)地為甘肅省隴西縣，購自安徽省亳州市中藥材市場；里氏木霉(Trichodermareesei)D-86271，購自芬蘭VTT技術(shù)中心；秀麗線蟲(Caenorhabditiselegans)，由筆者所在實驗室保存。百草枯，購自Sigma公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)等生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

PDA培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，15 g瓊脂粉，加蒸餾水至1 000 mL。

Mandels培養(yǎng)基：2.0 g KH2PO4，1.4 g(NH4)2SO4，0.3 g Urea，0.3 g MgSO4·7H2O，1.0 mL微量元素濃縮液(3.7 g/L CoCl2·6H2O，1.4 g/L ZnSO4·7H2O，1.6 g/L MnSO4·H2O，5.0 g/L FeSO4·7H2O)，10.0 g葡萄糖，0.3 g 酵母膏，加蒸餾水至1 000 mL。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基：1.5 g小麥麩，1.5 g脫木素麥稈，5.0 mL 10×Mandels培養(yǎng)基。具體配制方法參考文獻(xiàn)[12]。

1.2 試驗方法

1.2.1 固態(tài)發(fā)酵制備纖維素酶 參照文獻(xiàn)[12]中的方法進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵制備纖維素酶。取約108個里氏木霉孢子(PDA平板培養(yǎng)獲得)接種于100 mL Mandels培養(yǎng)基，并于28 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)2 d。將1 mL菌絲培養(yǎng)物接入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，混勻后30 ℃培養(yǎng)13 d。發(fā)酵結(jié)束后，每瓶發(fā)酵物中加入30 mL無菌水(含0.1%吐溫80)，置于25 ℃、120 r/min 條件下提取120 min。提取液經(jīng)8 000 r/min、10 min 離心后取上清液。所得粗酶液加入終濃度為0.02%的三氮化鈉，并置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 酶活性的測定 參照文獻(xiàn)[12]中的方法分別測定發(fā)酵液中濾紙酶、內(nèi)切型纖維素酶(CMC酶活)、β-葡萄糖苷酶及木聚糖酶的活性。酶活性測定均在50 mmol/L的檸檬酸緩沖液(pH值為4.8)中進(jìn)行，各設(shè)3個重復(fù)。1個單位(U)濾紙酶、CMC酶或木聚糖酶分別定義為1 min催化相應(yīng)底物生成1 μmol葡萄糖(濾紙酶和CMC酶)或木糖(木聚糖酶)的酶量；1個單位(U)的β-葡萄糖苷酶定義為1 min催化4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)生成1 μmol 4-硝基苯酚的酶量。

1.2.3 黃芪藥渣的獲得 黃芪經(jīng)粉碎后，按固液質(zhì)量比為 1 ∶10 加入蒸餾水，90 ℃、150 r/min水浴浸提2 h，5 000 r/min 離心10 min獲得上清液，重復(fù)提取1次。所得上清液加3倍體積的99%乙醇溶液，充分混勻，4 ℃靜置過夜，6 000 r/min、10 min離心，沉淀經(jīng)60 ℃烘干，即得黃芪粗多糖。所得黃芪殘渣烘干至恒質(zhì)量，裝袋密封備用。

1.2.4 酶法提取黃芪藥渣中的多糖

1.2.4.1 單因素試驗 稱取1 g黃芪藥渣裝入50 mL離心管中，加入5 mL 0.05 mol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH值為4.8)，分別加入不同量(0～10 U)的纖維素酶(以濾紙酶活性計算)，加入無菌水使總體積為10 mL。經(jīng)50 ℃酶解2 h后，反應(yīng)物經(jīng)80 ℃水浴提取4 h，離心法獲得上清液并經(jīng)醇沉法獲得粗多糖。粗多糖經(jīng)適當(dāng)稀釋后，以苯酚-硫酸比色法測定總糖含量，并以二硝基水楊酸(3，5-dinitrosalicylic acid，DNS)法測定寡糖含量，兩者之差即為多糖含量[13]。同時，比較不同酶解溫度(35～55 ℃)或酶解時間(1～8 h)對酶法制備黃芪多糖的影響。

1.2.4.2 正交優(yōu)化試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，對纖維素酶用量、酶解時間和酶解溫度進(jìn)行正交設(shè)計(表1)，優(yōu)化黃芪多糖提取的最佳酶解條件。

表1 L16(43)正交試驗設(shè)計表

1.2.5 黃芪多糖的抗氧化活性

1.2.5.1 DPPH自由基清除測定 根據(jù)文獻(xiàn)[14]進(jìn)行DPPH自由基清除測定，分別配制不同濃度(0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.40 mg/mL)的黃芪多糖。向10 mL玻璃試管中依次加入1 mL各濃度黃芪多糖待測液和2 mL 0.6 mg/L DPPH，混勻，室溫避光反應(yīng)30 min，測定517 nm處的吸光度。以50%乙醇作為空白對照，每個處理重復(fù)3次，求平均值。DPPH清除率的計算公式如下：

SCDPPH=(1-DS517 nm/DC517 nm)×100%。

式中：SCDPPH為DPPH的清除率；DS517 nm為樣品的吸光度；DC517 nm為對照的吸光度。

1.2.5.2 線蟲抗氧化測定 通過添加百草枯誘導(dǎo)秀麗線蟲產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷以評價黃芪多糖的抗氧化活性。將黃芪多糖制成一定濃度的溶液后，添加至培養(yǎng)有秀麗線蟲的96孔板中，于20 ℃培養(yǎng)48 h，再于每個孔里添加百草枯，使其終濃度為40 mmol/L。每24 h觀察1次線蟲存活情況并記錄線蟲存活數(shù)目，直至秀麗線蟲全部死亡，每組試驗所測秀麗線蟲數(shù)目不少于80條。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素酶的制備及酶活性測定

由圖1可知，粗酶液中的濾紙酶、β-葡萄糖苷酶、CMC酶和木聚糖酶的活性分別為2.02、1.99、167.00、53.90 U/mL?？梢?，固態(tài)發(fā)酵液中含有較高水平的纖維素酶和半纖維素酶。

2.2 酶法制備黃芪藥渣中多糖的影響因素

2.2.1 纖維素酶用量對黃芪多糖提取的影響 由圖2可知，未經(jīng)纖維素酶水解作用，從黃芪藥渣中水提獲得的多糖提取量為2.9 mg/g；纖維素酶用量為0.2 U/g時，多糖提取量達(dá)8.2 mg/g。增加纖維素酶的用量，多糖的提取量明顯升高，纖維素酶用量為4.0 U/g時，多糖提取量達(dá)到最大值，為 34.7 mg/g。繼續(xù)增加纖維素酶的用量，黃芪多糖的提取量無明顯變化。因此，提取黃芪多糖的最佳纖維素酶用量為 4.0 U/g。酶解處理獲得的多糖量最高可達(dá)未經(jīng)纖維素酶處理組的11.97倍。

2.2.2 酶解溫度對黃芪多糖提取的影響 酶解溫度對酶法制備黃芪多糖的效率有明顯的影響。由圖3可知，低溫(35 ℃)下，酶法提取黃芪多糖的提取量為27.9 mg/g。提高酶解溫度，黃芪多糖的提取量明顯增加，在45 ℃時，黃芪多糖的提取量達(dá)到最大值，為35.7 mg/g。繼續(xù)升高溫度，黃芪多糖的提取量明顯降低。因此，利用纖維素酶提取黃芪藥渣中黃芪多糖的最適溫度為45 ℃。

2.2.3 酶解時間對黃芪多糖提取的影響 由圖4可知，隨著酶解時間的延長，黃芪多糖的提取量明顯升高。酶解時間為4 h時，黃芪多糖的提取量達(dá)34.6 mg/g。進(jìn)一步延長酶解時間，多糖提取量呈現(xiàn)下降的趨勢。因此，酶解4 h為最佳的酶解時間。

2.3 正交優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，繼續(xù)對纖維素酶用量、酶解溫度、酶解時間這3個因素進(jìn)行正交設(shè)計優(yōu)化以獲得最佳的提取條件。正交試驗結(jié)果如表2所示，各因素對黃芪多糖提取量的影響程度表現(xiàn)為酶解溫度>纖維素酶用量>酶解時間。根據(jù)試驗結(jié)果優(yōu)化得最佳提取條件為酶解溫度45 ℃、纖維素酶用量 4.0 U/g、 酶解時間4 h。最后經(jīng)驗證，在此條件下黃芪多糖的提取量為44.6 mg/g。

表2 酶法提取黃芪多糖的正交試驗結(jié)果

2.4 黃芪多糖的抗氧化活性

由圖5可知，隨著黃芪多糖濃度的升高，其對DPPH自由基的清除率明顯提高，當(dāng)黃芪多糖濃度達(dá)到0.30 mg/mL時，其對DPPH自由基的清除率可達(dá)25.4%。繼續(xù)升高黃芪多糖的濃度，其對DPPH自由基的清除率則無明顯增加。

由圖6可知，0.30 mg/mL黃芪多糖能夠明顯提高線蟲的存活率，最長存活時間為9 d，比空白對照組(CK)延長4 d。由圖7可知，添加0.30 mg/mL黃芪多糖，秀麗線蟲的平均壽命為3.48 d，比對照組(2.67 d)提高了30.3%。因此，黃芪多糖明顯降低了百草枯對線蟲引起的氧化損傷，其具有良好的抗氧化作用。

3 結(jié)論與討論

水提醇沉工藝只能獲取黃芪組織中部分多糖，殘留的藥渣中仍含有豐富的多糖等活性物質(zhì)[9]，這部分物質(zhì)由于受組織中纖維素等結(jié)構(gòu)成分的限制而難以溶出。微生物等來源的纖維素酶能夠有效作用于黃芪組織中的纖維結(jié)構(gòu)，從而促進(jìn)黃芪多糖的提取[8，11，15]。相對于堿法(如氧化鈣水溶液)制備黃芪多糖，酶法制備具有條件溫和、產(chǎn)物純度高和綠色環(huán)保等優(yōu)勢。本試驗以里氏木霉固態(tài)發(fā)酵獲得了高活性的纖維素酶，以經(jīng)2次高溫水提處理的黃芪藥渣作為材料提取多糖。結(jié)果顯示，與未經(jīng)酶處理的對照組相比，酶解處理使黃芪多糖的提取量提高了11.97倍。正交優(yōu)化試驗結(jié)果表明，酶法制備多糖中的主要影響因素影響由大到小依次為酶解溫度、纖維素酶用量、酶解時間，而最佳酶解參數(shù)為酶解溫度45 ℃、纖維素酶用量 4.0 U/g、酶解時間 4 h，在此條件下，從黃芪藥渣中可獲得 44.6 mg/g 黃芪多糖。由此可見，纖維素酶對促進(jìn)黃芪藥渣中多糖的制備具有重要的意義。同時，是否存在更加有效的黃芪組織水解酶系以進(jìn)一步提高黃芪多糖的提取效率值得進(jìn)一步研究。

抗氧化活性是黃芪多糖的重要生理功能[16]。本試驗體外抗氧化試驗結(jié)果表明，酶法制備的黃芪多糖對DPPH自由基的清除率為25.4%，低于文獻(xiàn)報道值[14，17]。這可能與獲得的黃芪多糖分子量或結(jié)構(gòu)有一定的關(guān)系[18]。同時，以秀麗線蟲為模型測試黃芪多糖的體內(nèi)抗氧化能力，發(fā)現(xiàn)0.30 mg/mL黃芪多糖明顯增強(qiáng)了秀麗線蟲對百草枯的抗性，處理組線蟲的平均壽命延長了30.3%。結(jié)果表明，纖維素酶法制備的黃芪多糖具有結(jié)構(gòu)完整性，顯示出良好的抗氧化活性。利用纖維素酶技術(shù)促進(jìn)黃芪藥渣中多糖的制備，對實現(xiàn)黃芪資源的高效利用具有重要意義。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

[2]張 薔，高文遠(yuǎn)，滿淑麗.黃芪中有效成分藥理活性的研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志，2012，37(21)：3203-3207.

[3]Auyeung K K，Han Q B，Ko J K.Astragalusmembranaceus：a review of its protection against inflammation and gastrointestinal cancers[J].The American Journal of Chinese Medicine，2016，44(1)：1-22.

[4]Sun Q R，Jia N，Wang W X，et al.Protective effects of astragaloside Ⅳ against amyloid beta1-42 neurotoxicity by inhibiting the mitochondrial permeability transition pore opening[J].PLoS One，2014，9(6)：e98866.

[5]姜琛璐，湯 承，騫 宇，等.黃芪多糖免疫調(diào)節(jié)作用研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2013，34(11)：327-332.

[6]賀義恒，張紅夏，趙 曄，等.恒山黃芪中黃芪多糖提取工藝研究[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2013，20(3)：52-54.

[7]金芬芬，金錫姣，楊惠鑫，等.不同提取方法對黃芪多糖提取率影響的實驗研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2013，31(10)：2136-2138.

[8]董玲玲，黃 鑫，齊陽光，等.酶解-微波法提取黃芪多糖的工藝研究[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，39(5)：528-531.

[9]趙海燕，馬永平，劉雅靜.利用醇提藥渣提取黃芪多糖的工藝研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36(36)：15977-15978，15980.

[10]陸 潭，張李陽，陳玉勝.一種黃芪藥渣發(fā)酵產(chǎn)物的抗高尿酸血癥活性[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41(9)：288-291.

[11]鄭立穎，魏彥明，陳 龍.纖維素酶在黃芪有效成分提取中的應(yīng)用[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2005，40(1)：94-96.

[12]Long L，Ding D，Han Z，et al.Thermotolerant hemicellulolytic and cellulolytic enzymes fromEupenicilliumparvum 4-14 display high efficiency upon release of ferulic acid from wheat bran[J].Journal of Applied Microbiology，2016，121(2)：422-434.

[13]閆巧娟，韓魯佳，江正強(qiáng).纖維素酶法提取黃芪多糖[J].中草藥，2005，36(12)：1804-1807.

[14]吳 銘，韓 丹，郭立泉.黃芪多糖的提取與抗氧化活性檢測[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，54(17)：4263-4265.

[15]王文文，李小丹，黃齊磊，等.纖維素酶協(xié)同高壓熱水提取香菇多糖的研究[J].中國食品添加劑，2015(4)：106-110.

[16]李寶霞，董雙濤，霍乃蕊.黃芪多糖抗氧化活性研究[J].山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2011，12(5)：16-18.

[17]李金芳.黃芪多糖的提取及抗氧化作用研究[J].中國食品添加劑，2015(4)：143-147.

[18]李紅法，郭松波，滿淑麗，等.乙醇分級沉淀提取黃芪多糖及其理化性質(zhì)和抗氧化活性研究[J].中國中藥雜志，2015，40(11)：2112-2116.