超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定蘋果中滅菌丹殘留量

湯祝華 梁曉涵 王海靈 王丹 黨政

摘要 采用QuEChERS前處理方法聯(lián)合超高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）檢測(cè)，建立了蘋果中滅菌丹殘留量的檢測(cè)方法。依據(jù)滅菌丹的化學(xué)性質(zhì)特點(diǎn)優(yōu)化了流動(dòng)相組成和質(zhì)譜條件，滅菌丹的檢測(cè)線性范圍5～200 ng/mL，回收率93.6%～102.3%，RSD 0.5%～7.3%。結(jié)果表明：該方法簡(jiǎn)便快速、結(jié)果準(zhǔn)確，適用于蘋果中滅菌丹殘留量的測(cè)定。

關(guān)鍵詞 蘋果;滅菌丹;超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜;穩(wěn)定性

滅菌丹（folpet），化學(xué)名稱N-三氯甲硫基鄰苯二甲酰亞胺，是苯二甲酰亞胺的衍生物，屬于三氯甲硫基類殺菌劑。作為廣譜、高效的殺菌劑，滅菌丹可用于果樹、蔬菜中多種病害的防治，其滅殺效果好、藥害小，適當(dāng)使用還有刺激植物生長的作用[1-2]，廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。但是，美國環(huán)境保護(hù)署（EPA）公布的已評(píng)估致癌可能性的農(nóng)藥中，滅菌丹屬于可能的人類致癌物（c類）[3]。張業(yè)鵬[4]的DNA結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果顯示，滅菌丹或中間產(chǎn)物可以嵌插進(jìn)DNA雙螺旋中，柳云恩[5]等通過試驗(yàn)確定了95%滅菌丹原藥對(duì)SD大鼠的毒性作用，并得出前胃為潛在的毒性靶器官。因此，各國都對(duì)滅菌丹在水果蔬菜中的殘留量規(guī)定了最低的限量，我國現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)GB 2763-2016[6]對(duì)蘋果中滅菌丹的最大殘留量規(guī)定為10 mg/kg。

滅菌丹的檢測(cè)方法主要有薄層色譜法、液相色譜法、氣相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用法和液質(zhì)聯(lián)用法等[7-11]。目前，滅菌丹的國家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法通常用GB/T 20769-2008和GB/T 20770-2008，均為液質(zhì)聯(lián)用法[12-13]。QuEChERS （Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe），是近年來國際上最新發(fā)展起來的一種用于農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)的快速樣品前處理技術(shù)，2003年由美國農(nóng)業(yè)部開發(fā)[14]。本文在GB/T20769的基礎(chǔ)上，改用QuEChERS法為前處理，依據(jù)滅菌丹的化學(xué)性質(zhì)特點(diǎn)優(yōu)化了流動(dòng)相組成和質(zhì)譜條件，極大地提升了檢驗(yàn)效率和檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器設(shè)備

Waters Vevo TQ-S超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（UPLC-MS/MS）、IKA⑧T25均質(zhì)器、Eppendorf5804R臺(tái)式冷凍離心機(jī)、IKA振蕩器、梅特勒精密天平（XS205D/CP225D）。

1.1.2 主要試劑及標(biāo)準(zhǔn)品

蘋果（市售），丙酮（默克，色譜級(jí)），乙酸（默克，色譜級(jí)），甲酸（默克，色譜級(jí)），乙腈（默克，色譜級(jí)），水為超純水，PSA（美國艾杰爾科技有限公司），氯化鈉（廣試，AR，用前150℃烘6 h），醋酸鈉（廣試，AR），無水硫酸鎂（廣試，AR，用前500℃馬弗爐內(nèi)烘6h），陶瓷均質(zhì)子（Agilent公司）。

農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品：滅菌丹（99.0%，DR，Ehrenstorfer。

取滅菌丹對(duì)照品適量，用丙酮溶解，配制成濃度為1mg/mL的滅菌丹標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于0～4℃避光貯藏。用乙腈配制濃度為1.0μg/mL標(biāo)準(zhǔn)中間液。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

準(zhǔn)確稱取10 g勻漿后的蘋果樣品置于50 mL離心管中，加入2粒陶瓷均質(zhì)子，10mL乙酸乙腈溶液（1：99），渦旋振蕩2min，置于-20℃冰箱冷凍20min，加入4g無水硫酸鎂和1g醋酸鈉，1g氯化鈉，渦旋振蕩2min，離心5min （4℃，5000 r/min），準(zhǔn)確吸取6 mL上清液，放人事先裝有400 mg PSA，1200 mg無水硫酸鎂的15 mL離心管中，渦旋振蕩2 min，置于冷凍離心機(jī)中離心5min（4℃，5 000 r/min），取上清液經(jīng)0.22μm濾膜過濾，取濾液，待上機(jī)檢測(cè)。

1.2.2 儀器條件

1.2.2.1 超高效液相條件

色譜柱AcQuity UPLC C18 （1.7μm， 2.1mm×50mm）;流動(dòng)相乙腈（A）-流動(dòng)相0.1%甲酸水（B），梯度洗脫（0～0.5 min， 10%A;0.5～2.0min， 10%-75%A;2.0-4.0min，75%A;4.0～4.1 min， 75%～10%A;4.1～6.5 min，10% A）流速0.3 mL/min;柱溫40℃;進(jìn)樣量1μL。

1.2.2.2 質(zhì)譜條件

電離方式：電噴霧電離（ESIT）;掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（WIRM）;毛細(xì)管電壓3.0KV;離子源溫度150℃;脫溶劑氣氮?dú)饬髁?000 L/Hr、溫度400℃;錐孔氣氮?dú)饬髁?50 L/Hr;碰撞氣氬氣流量0.15mL/min。滅菌丹離子信息見表1，滅菌丹離子圖見圖1。

2 結(jié)果與分析

2.1 滅菌丹溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)（配制溶劑：甲醇）

滅菌丹，室溫下難溶解于水（1.0mg/L， 25℃），微溶于有機(jī)溶劑，純品在干燥條件下較穩(wěn)定，室溫下遇水緩慢水解，遇高溫或堿性物質(zhì)迅速分解[15]。國標(biāo)GB/T 20769-2008使用甲醇為溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，但在實(shí)際檢測(cè)工作中，連續(xù)監(jiān)測(cè)了滅菌丹在甲醇中的響應(yīng)值，檢測(cè)結(jié)果見圖2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，使用甲醇為溶劑配制的滅菌丹標(biāo)準(zhǔn)溶液以及樣品溶液的響應(yīng)值往往隨著時(shí)間變化迅速降低。

2.2 滅菌丹配制溶劑的比較

使用多種溶劑配制滅菌丹標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過在常溫下（25℃）放置2h，24h檢測(cè)其響應(yīng)值變化來研究滅菌丹的穩(wěn)定性，詳見表2。

結(jié)果顯示，使用不同溶劑配制的滅菌丹標(biāo)準(zhǔn)溶液儀器響應(yīng)值有較大差異，甲醇、乙腈/水（10：90）V/V溶劑的響應(yīng)值最低，乙腈及乙腈/0.1%甲酸水（60：40）V/V響應(yīng)值較高。在2h以內(nèi)，甲醇、乙腈/水（10：90） V/V溶劑中的滅菌丹不穩(wěn)定。24 h時(shí)，各種溶劑中的滅菌丹都有不同程度的分解?？梢姕缇ぴ诩状肌⑺疄橹黧w的溶劑中穩(wěn)定性很差，在乙腈為主體的溶劑中較為穩(wěn)定。此外，pH對(duì)滅菌丹穩(wěn)定性影響較大，添加甲酸可以提升滅菌丹的穩(wěn)定性，這與文獻(xiàn)報(bào)道的相一致[1]。但是，無論是調(diào)節(jié)pH還是使用乙腈作為溶劑，在放置較長時(shí)間后（24 h）仍比較容易分解。

2.3 方法學(xué)試驗(yàn)

用空白樣品提取液配制2、5、10、30、50、80、100、200 ng/mL滅菌丹系列標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行測(cè)定。以峰面積A為縱坐標(biāo).濃度C （5～200 ng/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，結(jié)果表明，當(dāng)滅菌丹的濃度在5～200 ng/mL時(shí)，存在良好的線性關(guān)系。用不含滅菌丹的蘋果樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)添加試驗(yàn)（添加水平分別為5、10、100 mg/kg），結(jié)果詳見表3。

2.4 脫溶劑溫度的優(yōu)化

因?yàn)闇缇な峭ㄟ^脫氯發(fā)生離子化，如圖3所示。因此溫度升高有利于滅菌丹脫氯，提高離子化效率。其他條件不變，分別在不同的脫溶劑溫度下測(cè)定滅菌丹的響應(yīng)值大小，結(jié)果如表4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明滅菌丹在脫溶劑溫度為400℃時(shí)響應(yīng)值最高。

3 討論與結(jié)論

從滅菌丹的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)可以看出，如果在前處理過程中花費(fèi)的時(shí)間過長，或者提取過程中的溶劑不合適，滅菌丹就有可能發(fā)生降解。與QuEChERS方法相比，傳統(tǒng)前處理方法的過程步驟較多，在處理的樣品數(shù)量比較大的情況下花費(fèi)的時(shí)間較長，往往回收率很低。QuEChERS方法簡(jiǎn)單，整個(gè)前處理過程通?？梢栽?～2h完成，以乙酸酸化的乙腈作為提取溶劑，不僅提升了滅菌丹的穩(wěn)定性，而且可以獲得比較準(zhǔn)確的結(jié)果。依據(jù)滅菌丹的化學(xué)性質(zhì)特點(diǎn)優(yōu)化了流動(dòng)相組成和質(zhì)譜條件，本文建立了蘋果中滅菌丹殘留量的檢測(cè)方法，即QuEChERS前處理方法聯(lián)合UPLC-MS/MS檢測(cè)。本方法靈敏度高，定性定量準(zhǔn)確，實(shí)驗(yàn)前處理簡(jiǎn)單快速，可有效地滿足蘋果中滅菌丹農(nóng)藥殘留檢測(cè)的要求，極大地提升了檢驗(yàn)效率和檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，為相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供了可靠的技術(shù)支撐。

參考文獻(xiàn)

[1]于彥彬，王淑菊，譚培功，等.同相萃取氣相色譜法測(cè)定水果中克菌丹和滅菌丹[J].分析化學(xué)，2008，36（6）：750-754.

[2]薛麗.QuEChERS氣相色譜法測(cè)定水果中三種殺菌劑殘留[J].廣東化工，2016，43 （13）：248-249.

[3]王以燕，許建寧，胡潔.美國EPA對(duì)農(nóng)藥致癌可能性的評(píng)估[J].農(nóng)藥.2009， 48（6）：462-466.

[4]張業(yè)鵬.光譜法研究三種具有潛在致癌性的農(nóng)藥與DNA相互作用機(jī)理[D].江西：南昌大學(xué)，2013.

[5]柳云恩，張玉彪，施琳，等.95%滅菌丹原藥對(duì)大鼠經(jīng)口毒性試驗(yàn)研究[J].中國公共衛(wèi)生，2013， 29（12）：1803-1805.

[6]樸秀英，單煒力，簡(jiǎn)秋，等.食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)——食品中農(nóng)藥最大殘留限量（GB2763-2012）介紹[J].農(nóng)藥科學(xué)與管理，2013 （2）：35-39.

[7]慕衛(wèi)，劉峰，孫作洋，等.克菌丹和滅菌丹的氣相和液相色譜分析方法[J]。分析試驗(yàn)室，2006，25（5）：107-109.

[8]周欣，臧曉歡，王東躍，等.分散液相微萃取氣相色譜聯(lián)用測(cè)定葡萄中百菌清、克菌丹和滅菌丹殘留[J].分析化學(xué)研究報(bào)告，2009，37（1）：41-45.

[9] SN/T 2320-2009，進(jìn)出口食品中百菌清、苯氟磺胺、甲抑菌靈、克菌靈、滅菌丹、敵菌丹和四溴菊酯殘留量檢測(cè)方法氣相色譜質(zhì)譜法[P].

[10]邵永源，修長澤，吳會(huì)進(jìn)，高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定水果中克菌丹和滅菌丹殘留量[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)論壇，2007， 13 （9）：827-829.

[11]史龍梅.食品中殺菌防腐保鮮劑的液相色譜分析[D].河北：河北大學(xué)，2015.

[12] GB/T 20769-2008，水果和蔬菜中450種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[P].

[13] GB/T 20770-2008，糧谷中486種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[P].

[14]胡四洲，程運(yùn)斌，胡定金.農(nóng)藥多殘留分析中QuEchERS方法介紹[J].現(xiàn)代農(nóng)藥，2006，5（4）：24-29，44.

[15]王淑菊.水果中農(nóng)藥殘留分析方法研究[D].山東：中國海洋大學(xué)，2007.