赤水曬醋中腐敗微生物的生長特性研究

何銀，唐杰，張惟廣

(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715)

食醋作為一種日常調(diào)味品，“多醋少鹽”、“重醋輕鹽”已成為現(xiàn)代人餐桌上的一種時尚追求[1]。醋含有氨基酸、糖類、維生素等營養(yǎng)成分，具有抗菌、殺菌等藥理功效[2]，并有助于防止感冒、腹瀉、骨質(zhì)疏松等[3]。赤水曬醋采用傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)方式，擁有悠久的歷史。固態(tài)發(fā)酵(solid-state fermentation, SSF)指在沒有或者幾乎沒有游離水的濕的固態(tài)天然物料作為培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物的發(fā)酵過程。其底物多是不溶于水的聚合物，它為微生物提供生長所需碳源、氮源、無機物、水分以及其他營養(yǎng)物質(zhì)并給微生物提供固定生長場所。固態(tài)發(fā)酵的本質(zhì)是在特定發(fā)酵條件下，利用微生物對發(fā)酵基質(zhì)中有機物的分解、代謝過程積累代謝產(chǎn)

物[4,5]。但固態(tài)發(fā)酵以手工操作為主，大部分依靠經(jīng)驗和積累，設(shè)備陳舊，生產(chǎn)周期長[6]，產(chǎn)品體態(tài)不夠澄清，保質(zhì)期內(nèi)會在瓶口出現(xiàn)浮圈，瓶底形成沉淀，這些現(xiàn)象影響了食醋的感官，甚至影響食醋品質(zhì)[7]。

本試驗以從赤水曬醋的腐敗醋中分離出的4株腐敗菌(枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、類芽孢桿菌(Paenibacillussp.Dg-1009)、耐熱芽孢桿菌(BacillussporothermoduransTCA20028)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)為研究對象，探究其在不同溫度、鹽度、酸堿度、防腐劑等因素下的生長狀況，并且確定這幾種微生物耐受高溫的溫度與時間，為解決食醋腐敗問題提供理論參考。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料與試劑

正常醋與腐敗醋由貴州赤水黔老翁醋廠提供；J1枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、J2類芽孢桿菌(Paenibacillussp.Dg-1009)、J4耐熱芽孢桿菌(BacillussporothermoduransTCA20028)、J7地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)由該醋廠的腐敗醋中分離得出。

瓊脂粉、氯化鈉、山梨酸鉀、苯甲酸鈉 成都市科龍化工試劑廠；牛肉膏、蛋白胨 北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004A型分析天平 上海精天電子儀器有限公司；PHS-3E型pH計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；LDZX-30KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；DPH-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱、DHG-9140型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；UV1000型可見分光光度計 上海天美科學(xué)儀器有限公司；DPH-9162型恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智誠分析儀器有限公司；SW-CJ-1FD型潔凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種的活化

取出保存于冰箱中的菌種，劃線于牛肉膏蛋白胨做成的平板培養(yǎng)基，并于(36±1) ℃培養(yǎng)24 h，活化2次。挑取1環(huán)菌種加入已滅菌的50 mL牛肉膏蛋白胨的液體培養(yǎng)基中，于(36±1) ℃搖床(轉(zhuǎn)速50 r/min)培養(yǎng)24 h。

1.3.2 測定方法

1.3.2.1 比濁法

采用吸光值來判定培養(yǎng)液中微生物數(shù)量，用分光光度計在600 nm處測定樣品的吸光度[8]。

1.3.2.2 菌落計數(shù)法

按照GB/T 4789.2-2016的方法進行計數(shù)。

1.3.3 不同因素對5種菌生長的影響

參考生產(chǎn)工藝條件并結(jié)合前人的研究制定了如下因素條件[9,10]，探究其在不同條件下的生長狀況。將制備好的J1，J2，J4，J7的菌懸液接種于50 mL的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，使接種后的濃度為105～106cfu/mL，于37 ℃搖床(90 r/min)培養(yǎng)24 h后測定菌液的OD600 nm值[11]，以下試驗均采用此接種和培養(yǎng)方法。

1.3.3.1 溫度

在溫度為10，15，20，25，30，35，40，45，50 ℃下培養(yǎng)，平行3次，并做空白對照。

1.3.3.2 鹽濃度

在氯化鈉含量分別為0，2%，4%，6%，8%，10%，12%，14%的50 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，平行3次，并做空白對照。

1.3.3.3 pH

用1 mol/L氫氧化鈉和1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的pH為3，3.5，4，4.5，5，5.5，6，6.5，7，7.5，8，平行3次，并做空白對照。

1.3.4 殺菌處理、防腐劑對菌株生長的影響

1.3.4.1 殺菌溫度對菌株生長影響

在0，80，90，100，110，120 ℃下分別處理20 min，平行3次，并做空白對照。

1.3.4.2 殺菌時間對菌株生長影響

按照如下條件處理： 90 ℃分別處理0，5，10，15，20，25，30 min；100 ℃分別處理0，5，10，15，20，25，30，35，40 min，平行3次，并做空白對照。

1.3.4.3 防腐劑對菌株生長影響

本研究選用山梨酸鉀和苯甲酸鈉這2種防腐劑作為研究對象，根據(jù)GB 2760-2014《食品添加劑使用標準》進行添加量的選擇，本實驗選用0.25，0.5，1 g/L 3個濃度的苯甲酸鈉和山梨酸鉀，添加到液體培養(yǎng)基中。

a.不同濃度防腐劑的配制

為較少誤差，加入防腐劑的體積不應(yīng)太大，因此配制高濃度的母液。首先用無菌水配制100 g/L山梨酸鉀母液，濃度1 g/L山梨酸鉀的配制：在無菌條件下，吸取0.5 mL山梨酸鉀母液加入到已滅菌的50 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，其他濃度防腐劑的配制如上述方法所示。

b.菌懸液接種

將制備好的菌懸液接入已經(jīng)加入不同濃度防腐劑的液體培養(yǎng)基中，每株菌平行2次并做空白對照，按照1.3.3.1的方法進行培養(yǎng)。

c.結(jié)果測定

對4株菌平板計數(shù)參考GB/T 4789.2-2016，根據(jù)結(jié)果計算出菌落總數(shù)，并按照以下公式計算抑菌率，由公式可以看出，抑菌率越大，防腐效果越好。

IR(%)=(k0-k)/k0×100。

式中：IR為抑菌率；k0為對照組菌落總數(shù)；k為添加不同防腐劑的菌落總數(shù)。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

使用Oringe軟件進行作圖，使用SPSS軟件分析及處理數(shù)據(jù)，顯著性采用Duncan's多重比較法(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)溫度對菌株生長的影響

J1，J2，J4，J7菌株在10，15，20，25，30，35，40，45，50 ℃下培養(yǎng)24 h后的OD600 nm值見圖1。

圖1 培養(yǎng)溫度對菌株生長的影響Fig.1 Effect of the culture temperature on the growth of strains

由圖1可知，在處理溫度范圍內(nèi)，隨溫度升高，4株菌的OD值均呈先升高后下降的趨勢。J1，J2，J7菌株在35 ℃時生長最好，其OD值分別為1.401，0.389，1.359。J4在40 ℃時OD值為0.437，達到最大。菌株J1，J2，J4，J7在培養(yǎng)溫度低于35 ℃時生長逐漸緩慢，在15 ℃時，OD值均小于0.1，生長受到抑制，在10 ℃時，OD值接近零，幾乎不生長。因此，可于15 ℃儲存食醋，以抑制腐敗菌生長。

2.2 含鹽量對菌株生長的影響

J1，J2，J4，J7菌株在氯化鈉含量分別為0，2%，4%，6%，8%，10%，12%，14%的培養(yǎng)基中生長24 h后，測得菌液OD值的變化，見圖2。

圖2 含鹽量對J1，J2，J4，J7菌株生長的影響Fig.2 Effect of sodium chloride content on the growth of J1，J2，J4，J7 strains

由圖2可知，在氯化鈉含量低于2%時，4株菌都能生長，且生長良好，J1，J2，J4，J7菌株均在氯化鈉含量為0時生長最好，OD值分別為1.316，0.420，0.347，1.426。在4株菌中J1，J7能耐受12%的含鹽量，較為耐鹽，J2，J4耐鹽性較差，最大耐受量分別為6%，5%。由試驗結(jié)果可知，4株芽孢桿菌具有較強的耐鹽性，在含鹽量為12%時菌株的生長基本受到抑制，含鹽量低于2%時菌株生長良好，本試驗所用醋的含鹽量為(1.97±0.02)%，為抑制菌株生長可將鹽分含量提高至3%，但仍需結(jié)合殺菌等其他控制條件。

2.3 pH對菌株生長的影響

J1，J2，J4，J7菌株在pH 3，3.5，4，4.5，5，5.5，6，6.5，7，7.5，8條件下培養(yǎng)24 h后，測得的菌液OD值變化，見圖3。

圖3 培養(yǎng)pH對菌株生長的影響Fig.3 Effect of culture pH on the growth of strains

由圖3可知，在處理pH范圍內(nèi)，隨pH升高4株菌OD值呈先升高后下降的趨勢，J1，J2，J4，J7菌株在pH 7.0時，生長最好，OD值分別為1.362，0.408，0.449，與其他pH處理比差異顯著。4株菌在pH 3.0時OD值接近0，菌株基本不生長。由結(jié)果可知，芽孢桿菌的耐酸性較強，本試驗所用醋的pH為3.6±0.03，雖能抑制部分菌株的生長，但仍有耐酸的芽孢桿菌生長，因此需要嚴格控制殺菌，以更好地抑制腐敗微生物的生長。

2.4 殺菌溫度對菌株生長的影響

J1,J2,J4,J7菌株在經(jīng)過不同溫度處理20 min后，培養(yǎng)24 h得到的菌液OD值見圖4。

圖4 殺菌溫度對J1，J2，J4，J7菌株生長的影響Fig.4 Effect of sterilization temperature on the growth of J1，J2，J4，J7 strains

由圖4可知，殺菌溫度從80～110 ℃，OD迅速下降，隨著殺菌溫度上升，OD值降低。在100 ℃殺菌20 min時，OD值明顯降低，說明一般生產(chǎn)中的100 ℃殺菌可以殺死大部分腐敗菌，但是仍有菌株殘留。當處理溫度達到120 ℃時，4株菌幾乎全被滅活，由此可知，芽孢桿菌耐高溫的能力較強。但在實際生產(chǎn)過程中，殺菌溫度過高會增加生產(chǎn)成本，甚至引起食醋口感變差，因此本試驗選擇較為適中的90 ℃和100 ℃進行殺菌溫度的探究。

2.5 殺菌時間對菌株生長的影響

2.5.1 90 ℃處理不同時間對菌株生長的影響

J1，J2，J4，J7菌株在90 ℃下處理0，5，10，15，20，25，30 min后，經(jīng)過24 h培養(yǎng)后得到的菌液濃度的OD值見圖5。

圖5 90 ℃高溫處理對J1，J2，J4，J7菌株生長的影響Fig.5 Effect of high-temperature processing at 90 ℃on the growth of J1,J2,J4,J7 strains

由圖5可知，J1，J2，J4，J7菌株在90 ℃，20 min處理后OD值變化均不顯著，90 ℃的處理并不能達到很好的滅菌效果，因此，采用100 ℃再次處理，并延長處理時間。

2.5.2 100 ℃溫度處理不同時間對菌株生長的影響

J1,J2,J4,J7菌株在100 ℃下處理0，5，10，15，20，25，30，35，40 min處理后，經(jīng)24 h培養(yǎng)得到的菌液OD值見圖6。

圖6 100 ℃高溫處理對J1,J2,J4,J7菌株生長的影響Fig.6 Effect of high-temperature processing at 100 ℃ on the growth of J1,J2,J4,J7 strains

由圖6可知，在100 ℃時，J1,J7菌株需要處理35 min，J2,J4菌株需要處理30 min才能將菌株滅活。本試驗研究的4種腐敗菌均為芽孢桿菌，耐熱性較好，為盡量延長食醋的保質(zhì)期，可在較低溫度下儲存食醋，并在保證口感的前提下可稍提高含鹽量，降低酸度，宜采用100 ℃左右的高溫殺菌35 min。

2.6 防腐劑抑菌效果

不同濃度的防腐劑對菌株J1,J2,J4,J7生長的影響結(jié)果見表1和表2。

表1 不同濃度山梨酸鉀對菌株生長的影響Table 1 Effects of different concentration of potassium sorbate on the growth of strains

表2 不同濃度苯甲酸鈉對菌株生長的影響Table 2 Effects of different concentration of sodium benzoate on the growth of strains

2.6.1 防腐劑對J1菌株的影響

不同濃度的防腐劑對J1菌株的抑菌率結(jié)果見圖7。

圖7 防腐劑對J1菌株的影響Fig.7 Effects of preservative on J1 strain

由圖7可知，2種防腐劑對J1菌株的抑菌率都在94%以上，當2種防腐劑按照1 g/L的濃度添加時，山梨酸鉀和苯甲酸鈉的抑菌率分別97.65%,96.47%，山梨酸鉀效果較優(yōu)。

2.6.2 防腐劑對J2菌株的影響

不同濃度防腐劑對J2菌株的抑菌率結(jié)果見圖8。

圖8 防腐劑對J2菌株的影響Fig.8 Effects of preservative on J2 strain

由圖8可知,在3種濃度下，苯甲酸鈉對J2菌株的抑菌率均在99%以上，苯甲酸鈉對J2菌株的抑菌率優(yōu)于山梨酸鉀。

2.6.3 防腐劑對J4菌株的影響

不同濃度防腐劑對J4菌株的抑菌率結(jié)果見圖9。

圖9 防腐劑對J4菌株的影響Fig.9 Effects of preservative on J4 strain

由圖9可知，當按照1 g/L的濃度添加時，山梨酸鉀和苯甲酸鈉對J4菌株的抑菌率分別為99.25%，95.18%，山梨酸鉀的抑菌效果優(yōu)于苯甲酸鈉。

2.6.4 防腐劑對J7菌株的影響

不同濃度的防腐劑對J7菌株的抑菌率結(jié)果見圖10。

圖10 防腐劑對J7菌株的影響Fig.10 Effects of preservative on J7 strain

由圖10可知，2種防腐劑對J7菌株的抑菌率均在96%以上，不同濃度的山梨酸鉀對J7菌株的生長影響較大，在最大濃度時抑菌率達到98.53%。在濃度大于0.5 g/L時的抑菌效果差別并不大，但苯甲酸鈉稍優(yōu)于山梨酸鉀。

根據(jù)防腐劑試驗得出：若是要同時抑制食醋中的這4種菌，山梨酸鉀效果優(yōu)于苯甲酸鈉，山梨酸鉀在最大濃度添加時，對J1菌株的抑菌率為97.65%，對J2菌株的抑菌率為96.72%，對J4菌株的抑菌率為99.25%，對J7菌株的抑菌率為98.53%。由表1和表2可知，雖然防腐劑對腐敗菌的生長有一定的抑制效果，但是若初始菌濃度過高，添加防腐劑后的菌濃度仍然較高，因此，若是殺菌條件控制不好，僅通過添加防腐劑不能保證產(chǎn)品品質(zhì)。

3 結(jié)論

J1,J2,J4,J7菌株在15 ℃時生長很微弱，在溫度為10 ℃時幾乎不生長；J1，J2，J4，J7菌株能耐受的最大鹽度分別為12%，6%，5%，12%；在pH 4.0以下時，所有菌株生長微弱，受到抑制，pH 3.0時OD值接近0，不能生長。若殺菌時間在20 min時，應(yīng)選用120 ℃才能完全滅活，選用100 ℃殺菌時，需要處理35 min才能將菌株滅活。若是要同時抑制食醋中的這4種菌，山梨酸鉀的效果優(yōu)于苯甲酸鈉，在最大濃度添加時，對這4株菌的抑制率均為96%以上。

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