歐陽尋麗 李 寒 孫曉彤 張 彥 李 霞 魏 晶

(大連醫(yī)科大學,大連 116044)

RA是一種病因不明，以滑膜增生和關節(jié)軟骨破壞為特征的自身免疫病，其病因和發(fā)病機制尚不明確。其主要病理表現為滑膜襯里層成纖維細胞增生，導致滑膜襯里層增厚，繼而向血管翳轉化，最終引起軟骨和骨的侵蝕破壞。FLS在RA中異常活化[1]，活化的FLS可分泌多種細胞因子、趨化因子和基質降解酶等活性介質，介導炎癥反應，引起骨和軟骨組織的破壞[2]。IL-34是近年新發(fā)現的一種細胞因子，具有增強單核細胞活力、調節(jié)髓樣細胞生長分化、加速破骨細胞形成等生物學功能[3,4]。有研究表明轉化生長因子和骨形成蛋白2可抑制RA FLS IL-34的表達[5]。我們及其他研究者發(fā)現RA患者血清IL-34水平升高，且與疾病病情活動有關[6-8]，但IL-34對RA FLS的作用尚不清楚。CCL28是近年新發(fā)現的一種CC類趨化因子[9]，在炎癥、腫瘤免疫中起重要作用，但關于CCL28參與自身免疫病的相關報道甚少，尤其在RA FLS中的作用機制尚無報道。本實驗通過研究IL-34對RA FLS CCL28表達的影響，初步探討其在RA發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1研究對象 關節(jié)滑膜組織取自大連醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院關節(jié)外科行關節(jié)置換術的RA患者，本研究得到大連醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院倫理委員會支持(批準文號：2015-02),所有患者均簽署知情同意書，且均符合1987年ACR修訂的RA分類標準[10]，并排除其他風濕性疾病，其中男性2例，女性4例。

1.1.2主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、青-鏈霉素、胰酶購買于美國Hyclone公司，胎牛血清購自美國Gibco公司，IL-34及受體拮抗劑購于R&D公司，c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)抑制劑(SP600125)、p38 MAPK抑制劑(SB203580)、NF-κB抑制劑(IKK-16)、細胞外調節(jié)蛋白激酶 (Extracellular regulated protein kinases，Erk)抑制劑(FR180204)均為美國Selleck公司產品，RNAiso plus、反轉錄試劑盒購于寶生物公司，ELISA試劑盒購于南京森貝伽生物科技公司，酶標分析儀為BioTek ELX-800，購于美國寶特公司。

1.2實驗方法

1.2.1RA患者FLS分離、培養(yǎng)與鑒定 無菌條件下獲取手術中RA患者的滑膜，浸泡于預冷DMEM培養(yǎng)基中，無菌磷酸鹽緩沖液洗滌，去除殘留脂肪和結締組織，將滑膜剪成1 mm3小塊，加入膠原酶Ⅰ(2.5 mg/ml)，37℃消化2 h，200目鋼網過濾，1 000 r/min離心5 min后用無血清的DMEM培養(yǎng)基洗滌，加入含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素(P/S)的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。選取第 4 代進行表型鑒定(CD14-、CD68-、Vimentin+>95%)，確認后第3～5代細胞用于實驗。

1.2.2IL-34刺激FLS 將6株FLS分別接種于6孔板中，調整細胞密度約為2×104個/ml。細胞分為三組：刺激組、受體拮抗劑組和信號通路抑制劑組。刺激組：每孔加入IL-34(100 ng/ml) 刺激細胞0、6、24、48、72 h，刺激6 h的細胞提取RNA，收集0、24、48、72 h上清用于ELISA檢測；受體拮抗劑組：每孔先加入集落刺激因子1受體(Colony stimulating factor 1 recepter，CSF-1R)抗體(100 ng/ml)，37℃，5%CO2孵箱孵育1 h后，再加入IL-34(100 ng/ml)刺激48 h；信號通路抑制劑組：每孔分別加入IKK-16、SP600125、SB203580、FR180204各10 μmol/L，37℃，5%CO2孵箱孵育1 h后加入IL-34(100 ng/ml)刺激細胞48 h。收集各組細胞培養(yǎng)上清用于ELISA檢測。

1.2.3RNA抽提和反轉錄 將上述方法培養(yǎng)的FLS按1×105個/ml傳入6孔板中，按試劑盒說明書常規(guī)操作提取總RNA并反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增，引物序列見表1，退火溫度為58℃。所得產物用Syber GreenⅠ預染的2%瓊脂糖凝膠進行電泳，結果于紫外燈下觀察。

1.2.4ELISA方法檢測上清CCL28水平 采用ELISA雙抗體夾心法檢測細胞培養(yǎng)上清中CCL28水平，具體操作按說明書進行。試劑盒靈敏度為 2 ng/L。

2 結果

2.1IL-34促進RA患者FLS CCL28的表達 采用RT-PCR法檢測IL-34刺激FLS 6 h后CCL28 mRNA的表達。結果顯示，與未刺激組相比，IL-34刺激的RA FLS其CCL28 mRNA的表達明顯升高(圖1A)；ELISA檢測IL-34刺激RA FLS 0、24、48、72 h后上清CCL28水平，結果顯示，與未刺激組相比，在不同時間點IL-34刺激的FLS分泌CCL28均增加且呈時間依賴性(P<0.05，圖1B)。表明IL-34可能上調RA FLS表達CCL28。

表1引物序列

Tab.1Primersequences

GeneUpstreamDownstreamGAPDH5′?TGACCACAGTCCATGCCATCAC?3′5′?CGCCTGCTTCACCACCTTCTT?3′CCL285′?CCATACTTCCCATTGCCTCC?3′5′?TGCCCTGTTACTGTTCCTCTTG?3′

圖1 IL-34刺激前后RA患者FLS CCL28表達情況Fig.1 Expressions of CCL28 of FLS in RA FLS before and after IL-34 stimulationNote: *.P<0.05，compared with the control.

圖2 加入CSF-1R抗體前后RA FLS分泌CCL28水平的變化Fig.2 Comparison of CCL28 levels in RA FLS with or without CSF-1R antagonist treatmentNote: *.P<0.05，compared with the control.

2.2IL-34通過與IL-34受體結合促進FLS表達CCL28 多個研究發(fā)現RA FLS表面高表達IL-34受體,為驗證IL-34是否通過與其受體結合介導CCL28的表達，本實驗在IL-34刺激的RA FLS培養(yǎng)體系中入CSF-1R抗體后再培養(yǎng)48 h后用ELISA測定細胞培養(yǎng)上清CCL28水平。結果顯示，與未加入拮抗劑組相比，加入拮抗劑后IL-34刺激的RA FLS CCL28水平明顯降低(P<0.05，圖2)。提示IL-34可能通過RA FLS表面的CSF-1R結合而發(fā)揮作用。

2.3IL-34激活p38 MAPK和NF-κB信號通路促進RA FLS 分泌CCL28 在RA FLS中先加IKK-16、SP600125、SB203580、FR180204孵育1 h后，再加IL-34刺激48 h，利用ELISA檢測上清中CCL28水平。結果顯示，與未加入信號抑制劑組相比，加入SB203580和IKK-16后RA FLS分泌CCL28水平明顯下降(P<0.05)，而加入SP600125、FR180204后CCL28水平沒有明顯變化(P>0.05，圖3)。說明IL-34可能通過激活p38 MAPK和NF-κB通路促進RA FLS分泌CCL28。

圖3 信號通路抑制劑作用前后IL-34刺激RA FLS分泌CCL28水平的變化Fig.3 Levels of CCL28 of FLS in RA FLS before or after adding signaling pathway inhibitorsNote: *.P<0.05，compared with the control.

3 討論

RA是一種常見的自身免疫病，漸進性關節(jié)軟骨及骨質破壞伴累及正常關節(jié)為該病的主要致殘原因。有研究表明FLS是RA損傷的主要細胞[1]，活化的FLS可使滑膜組織中大量炎性細胞(T淋巴細胞、B淋巴細胞、巨噬細胞等)浸潤由循環(huán)穿過血管內皮外滲至炎癥關節(jié)，此過程趨化因子發(fā)揮重要作用[2]。CCL28也稱黏膜相關上皮趨化因子，廣泛表達于黏膜組織的上皮細胞，唾液腺、乳腺、結腸和直腸表達較豐富。CC類趨化因子受體10(CC motif chemokine receptor 10，CCR10)和CCR3是CCL28的兩個受體[11]，其與受體結合后可參與黏膜反應、炎癥反應、腫瘤免疫調節(jié)等。有研究者發(fā)現原發(fā)干燥綜合征(primary Sj?gren′s syndrome，pSS)的患者唾液中CCL28明顯降低[12]，特應性皮炎、銀屑病、大皰性類天皰瘡的患者血清中CCL28明顯升高[13]，提示其可能參與了自身免疫病的發(fā)病過程。也有研究表明CCL28和CCL10在RA患者滑膜組織的髓系細胞和內皮細胞均有表達，其可與內皮細胞上的CCR10結合激活Erk信號通路促進血管翳形成，加重RA患者病情[14]。

IL-34是由241個氨基酸組成的二聚體蛋白，在心、肝、腦、脾等多種組織中均可表達，尤其在脾臟中呈高表達[3]，能誘導人全血中IL-6、IL-8、干擾素誘導蛋白10、單核細胞趨化蛋白1產生[15]，也能促進人外周血單核細胞的生存以及骨髓培養(yǎng)中巨噬細胞集落形成單位的形成[3]。近來大量的研究已經證實IL-34與多種自身免疫性疾病以及炎癥性疾病密切相關，如RA、潰瘍性結腸炎、pSS、冠狀動脈炎等，尤其在類風濕關節(jié)炎中研究較為深入[16-18]。我們前期的研究證實RA患者血清IL-34的表達水平明顯增高[8]，且在IL-34增高的患者中，IL-34升高程度與類風濕因子以及抗環(huán)狀瓜氨酸抗體表達量呈正相關[7]。推測IL-34可能通過影響RA發(fā)病中的某些主要效應細胞的功能加重RA患者病情，而FLS是介導RA損傷的主要效應細胞，我們?yōu)檠芯縄L-34對RA FLS是否有影響，因此在體外用IL-34刺激FLS，結果顯示IL-34刺激后FLS CCL28的表達明顯升高。表明IL-34可能通過刺激FLS分泌CCL28參與RA的病理過程。

IL-34通過與其受體結合可參與多種疾病生理和病理過程，包括細胞分化、增殖、炎癥和免疫反應，RA FLS高表達CSF-1R，且CSF-1R是IL-34的受體之一[19-21]。我們的實驗結果表明IL-34通過與CSF-1R結合上調RA FLS表達CCL28。既然IL-34與RA FLS表面的CSF-1R相互作用上調CCL28的表達，我們深入信號通路研究，加入JNK、p38 MAPK、NF-κB、Erk相關信號通路抑制劑后，結果顯示抑制p38 MAPK和NF-κB通路后RA FLS分泌CCL28明顯減少，提示IL-34刺激RA FLS分泌CCL28可能是通過激活p38 MAPK和NF-κB實現的。

綜上所述，本研究表明IL-34可與CSF-1R結合通過激活p38 MAPK和NF-κB通路促進RA FLS表達CCL28從而介導RA的炎癥反應,但IL-34在RA發(fā)病機制中的具體作用尚待進一步探討。

[1] Muller-Ladner U,Ospelt C,Gay S,etal.Cells of the synovium in rheumatoid arthritis.Synovial fibroblasts [J].Arthritis Res Ther,2007,9(6):223-233.

[2] Huber LC,Distler O,Tarner I,etal.Synovial fibroblasts:key players in rheumatoid arthritis [J].Rheumatology(Oxford),2006,45(6):669-675.

[3] Lin H,Lee E,Hestir K,etal.Discovery of a cytokine and its receptor by functional screening of the extracellular proteome [J].Science,320(5877):807-811.

[4] Guilonneau C,Bézie S,Anegon I.Immunoregulatory properties of the cytokine IL-34 [J].Cell Mol Life Sci,2017,74(14)：2569-2586.

[5] Chemel M,Brion R,Segaliny AI,etal.Bone morphogenetic protein 2 and transforming growth factor β1 inhibit the expression of the proinflammatory cytokine IL-34 in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts [J].Am J Pathol，2017,187(1):156-162.

[6] Tian Y,Shen H,Xia L,etal.Elevated serum and synovial fluid levels of interleukin-34 in rheumatoid arthritis:possible association with disease progression via interleukin-17 production [J].J Interferon Cytokine Res,2013,33(7):398-401.

[7] Moon SJ,Hong YS,Ju JH,etal.Increased levels of interleukin 34 in serum and synovial fluid are associated with rheumatoid factor and anticyclic citrullinated peptide antibody titers in patients with rheumatoid arthritis [J].J Rheumatol,2013,40(11):1842-1849.

[8] Wang B,Ma ZJ,Wang MM,etal.IL-34 upregulated Th17 production through increased IL-6 expression by rheumatoid fibroblast-like synoviocytes[J].Mediators Inflamm，2017:1567120

[9] Wang W,Soto H,Oldham ER，etal.Identification of a novel chemokine (CCL28),which binds CCR10 (GPR2) [J].J Biol Chem,2000,275(29):22313-22323.

[10] Arentt FC,Edworthy SM,Bloch DA,etal.The ARA 1987 revised criteria for classification on rheumatoid arthritis [J].Arthritis Rheum,1988,31(3):315-324.

[11] Pan J,Kunkel EJ,Gosslar U,etal.A novel chemokine ligand for CCR10 and CCR3 expressed by epithelial cell sinmucosal tissues [J].J Immunol,2000,165(6):2943-2949.

[12] Hernandez-Molina G,Burkhardt AM,Lima G,etal.Absence of salivary CCL28 in primary Sj?gren′s syndrome [J].Rheumatol Int,2015,35(8):1431-1434.

[13] Kagami S,Kakinuma T,Saeki H,etal.Increased serum CCL28 levels in patients with atopic dermatitis,psoriasis vulgaris and bullous pemphigoid [J].J Invest Dermatol ,2005,124(5):1088-1090.

[14] Chen Z,Kim SJ,Essani AB,etal.Characterising the expression and function of CCL28 and its corresponding receptor,CCR10,in RA pathogenesis [J].Ann Rheum Dis,2015,74(10):1898-1906.

[15] Eda H,Zhang J,Keith RH,etal.Macrophage-colony stimulating factor and interleukin-34 induce chemokines in human whole blood [J].Cytokine,2010,52(3):215-220.

[16] Chemel M,Le Goff B,Brion R,etal.Interleukin 34 expression is associated with synovitis severity in rheumatoid arthritis patients [J].Ann Rheum Dis,2012,71(1):150-154.

[17] Das LM,Katz J ,Awais D，etal.Increased levels of IL-34,a novel colony stimulating cytokine in the intestinal lesions of ulcerative colitis patients [J].Gastroenterology,2012,142(5):s872-s873.

[18] Ciccia F,Alessandro R,Rodolico V,etal.IL-34 is overexpressed in the inflamed salivary glands of patients with Sjogren′s syndrome and is associated with the local expansion of pro-inflammatory CD14brightCD16+monocytes [J].Rheumatology,2013,52 (6):1009-1017.

[19] Hume DA,Freeman TC.Transcriptomic analysis of mononuclear phagocyte differentiation and activation [J].Immunol Rev,2014,262(1):74-84.

[20] Liu H,Leo C,Chen X,etal.The mechanism of shared but distinct CSF-1R signaling by the non-homologous cytokines IL-34and CSF-1[J].Biochim Biophys Acta,2012,1824(7):938-945.

[21] Yang S,Jiang S,Wang Y,etal.Interleukin 34 upregulation contributes to the increment of microRNA 21 expression through STAT3 activation associated with disease activity in rheumatoid arthritis [J].J Rheumato,2016,43(7):1312-1319.