意大利豬圓環(huán)病毒3型的檢測及遺傳特征分析

摘譯自 S． Faccini等， Transbound Emerg Dis．2017：1-4．咸 文，梁海英，曾智勇

（貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

薦語：圓環(huán)病毒3型（PCV3）是具有豬皮炎腎病綜合征和繁殖障礙的臨床樣品中鑒定出的一種新型圓環(huán)病毒，意大利研究者通過qPCR技術(shù)對樣品中PCV3進行篩選并對其基因序列做出分析，使之成為第一個報告PCV3的歐洲國家。為幫助養(yǎng)豬從業(yè)者更好地了解PCV3的相關(guān)信息，特對目前僅有的幾篇PCV3相關(guān)研究文獻進行摘譯以饗讀者，并期待能有越來越多的相關(guān)研究來盡快揭示PCV3流行病學(xué)信息及遺傳特征，為國內(nèi)對該病毒的研究奠定一定基礎(chǔ)。

曾智勇，男，1978年9月生，四川威遠人，博士，貴州大學(xué)教授、碩士研究生導(dǎo)師、貴州大學(xué)學(xué)術(shù)骨干，貴州省科技特派員，黑龍江畜牧獸醫(yī)雜志編委。主要從事動物傳染病及病原分子生物學(xué)相關(guān)研究，以規(guī)?；i場主要病毒性疫病為基礎(chǔ)，開展新型疫苗和病原快速檢測方法及試劑盒的研發(fā)。同時，長期面向豬場開展豬病毒性疫病的抗體監(jiān)測和病原的快速檢測以及規(guī)模化豬場疾病防控指導(dǎo)，為豬場提供技術(shù)支持。

豬圓環(huán)病毒3型 (PCV3) 是一種新型豬圓環(huán)病毒，已經(jīng)被美國和中國的研究人員先后報道?，F(xiàn)有報道表明PCV3與豬皮炎腎病綜合征，繁殖障礙及和全身炎癥性疾病有關(guān)。文內(nèi)報道了PCV3在意大利的發(fā)生情況。PCV3在位于其波河流域的兩個農(nóng)場的豬胎兒和死產(chǎn)仔豬的組織中被檢測到，兩株意大利PCV3毒株的基因組與GenBank中其他毒株的序列相似性度為97．8%～99．7%，該研究進一步加強了PCV3作為一種新興的豬圓環(huán)病毒，在世界范圍內(nèi)普遍存在的推測。為此，加強該病毒相關(guān)流行病學(xué)及致病性的研究，顯得尤為急迫。

本研究參考2016年P(guān)alinski等人報道的方法，將經(jīng)PBS（0．1M， pH7．4）10倍 稀 釋 的 臨 床組織勻漿樣品后，使用One-For-All Vet Kit（Qiagen）提取核酸，以含有PCV3-US/SD2016 (KX966193) 毒株第1 392～1 575位人工合成核苷酸序列的重組質(zhì)粒為陽性對照，通過實時PCR（qPCR）對臨床樣品進行PCV3感染情況的篩查。同時，也對這些臨床樣品分別進行PRRSV、PCV2、PPV1、PPV2、PPV4、PRV的病原檢測。對于PCV3 qPCR陽性的樣品，參考2016年P(guān)alinski等人報道的方法，就病毒cap基因約330 bp大小的片段進行PCR擴增和測序以求進一步確證；而后，參照該文獻方法，進一步擴增獲得PCV3的全基因序列，并應(yīng)用相關(guān)分子生物學(xué)軟件進行病毒基因組遺傳特征的分析。

所有PCV3待查樣品系2017年3-4月期間送至曼托瓦IZSLER實驗室進行繁殖障礙病原檢測的臨床組織樣品，共來自9個養(yǎng)殖場。其中7個養(yǎng)殖場位于曼托瓦省，2個位于波河流域的不同省。通過qPCR檢測，共篩查出16份豬流產(chǎn)胎兒和死胎樣品中存在PCV3。死胎肺臟組織中的病毒載量較高，每微升DNA提取物中約為1×107個基因組拷貝（相當于1 g組織樣品中基因組拷貝為 1×1011）。2017年 3月初，第一個被確診為PCV3陽性的樣品，來自科摩省的一個小型有機農(nóng)場，該場有8頭母豬，幾周來持續(xù)發(fā)生繁殖障礙。同年3月底，第二個被確診的樣品系3只死胎的混合組織樣品，來源于曼托瓦省的一個養(yǎng)殖場（其距科摩省相關(guān)農(nóng)場134 km），其有較高的病毒載量，每微升DNA提取物中約為1×106個基因組拷貝；在死胎的腦，肺，胸腺和心臟的組織樣品中，均可檢測到PCV3的存在，其中腦組織樣品中的病毒載量為1×109拷貝/g，胸腺中為1×1010拷貝/g。PCV3檢測為陽性的死胎，其肺臟組織學(xué)檢測結(jié)果均顯示無明顯的病理損傷。該場對不同胎齡流產(chǎn)情況進行了記錄，其流產(chǎn)率僅為1．9%，并不嚴重；此外，分別來源于該場兩頭母豬的兩組流產(chǎn)胎兒樣品，其PCV3結(jié)果卻均為陰性。

上述陽性樣品的其他病原的qPCR檢測結(jié)果均為陰性，參照Palinski等人的方法進行病毒細胞分離未獲成功。將獲得的2株P(guān)CV3意大利株的全基因組序列上傳至GenBank，并分別命名為 PCV3-IT / CO2017（MF162298）和 PCV3-IT / MN2017（MF162299）。同源性分析表明，這兩個意大利株在基因組水平上有9 9．8 5%的核苷酸序列同源性，均屬于PCV3；與GenBank中已知的PCV3核苷酸相似性為 97．75% ～ 99．70%，與美國和中國重慶及江西毒株位于同一進化分支上；3個主要的ORFs與已報道的毒株相似。其中，O RF1編碼復(fù)制相關(guān)蛋白（Rep蛋白），均位于223～1 133 nt處，可編碼296個氨基酸，起始密碼子均為“G TC”。上述意大利的2個PCV3毒株的Rep蛋白氨基酸序列相似性為99%，這主要是由于1個核苷酸的替代G856A導(dǎo)致保守的氨基酸發(fā)生改變E286K所致；其與所分析的PCV3毒株的Rep基因的核苷酸序列相似性為96．70%～100%，推導(dǎo)氨基酸序列相似性為98．65%～100%。blastp分析結(jié)果表明，Re p蛋白中存在兩個保守結(jié)構(gòu)域，即病毒復(fù)制蛋白超家族（9～93 aa）和典型的RNA解旋酶家族（162～ 251 aa）。ORF2與 ORF1方向相反，均位于1 343～1 987 nt處，編碼Cap蛋白；意大利兩個毒株Cap蛋白具有100%的推導(dǎo)氨基酸序列相似性，且其他毒株的相似性 為 98．13% ～ 100%。ORF3位 于602～1 907 nt處，推導(dǎo)編碼蛋白大小為231 aa，與Rep蛋白類似，其起始密碼子尚不確定。2株意大利毒株的預(yù)測起始密碼子為“TTT”（編碼苯丙氨酸），該起始密碼子較為特殊；與Palinski等人的描述一致，位于55 aa（69 bp）的蛋氨酸可能是另一種的起始位點，可產(chǎn)生177個氨基酸大小的蛋白，其與PorkNW2/USA/2009（HQ738638）中的相應(yīng)蛋白氨基酸序列相似性為94%。

意大利是首次報道PCV3的歐洲國家，兩株意大利PCV3毒株與美國和中國毒株密切相關(guān)。如前所述，該病毒與豬繁殖障礙有關(guān)。在報道的上述兩個病例中，PCV3均是唯一檢測到的病原體，但PCV3的病原學(xué)作用仍不能被確定。為了更好地了解PCV3，目前正在對其流行病學(xué)，病毒學(xué)和病理學(xué)進行進一步的研究。