李雯曦

【摘要】 目的：觀察煙草煙霧暴露人氣道上皮細胞（16HBE）后，發(fā)生間充質轉分化（EMT）樣改變。方法：（1）以不同濃度（5～50 μg/mL）CSC刺激16HBE 7 d，用CCKit-8檢測細胞總體活性，篩選最佳濃度。（2）用CSC最大活性影響濃度刺激16HBE 7 d，觀察細胞形態(tài)改變，經(jīng)Western-blot法和細胞免疫熒光技術檢測上皮細胞標志物E鈣黏蛋白（E-cad）及EMT標記物1型膠原（COL1）、波形蛋白（Vimentin）和基質金屬蛋白酶9（MMP-9）的表達水平。結果：（1）不同濃度CSC刺激后，16HBE在

10 μg/mL時OD值最高，為（2.562±0.045）。各濃度間OD值比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。（2）經(jīng)10 μg/mL CSC刺激后，部分16HBE形態(tài)由鵝卵石狀向長梭形、多角形或星形改變。（3）Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)試驗組COL1、MMP-9的蛋白表達量分別為（0.566±0.011）和（0.463±0.003），高于對照組（0.272±0.020）和（0.201±0.023），差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；而E-cad蛋白表達量則明顯低于對照組，分別為（0.301±0.041）和（0.591±0.068），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。（4）細胞免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)試驗組COL1、Vimentin和MMP-9蛋白表達量均高于對照組（P<0.05）；而E-cad蛋白表達量明顯低于對照組（P<0.05）。結論：經(jīng)CSC刺激后，16HBE可出現(xiàn)轉分化樣改變。

【關鍵詞】 煙草煙霧凝集物； 氣道上皮細胞； 上皮細胞間充質轉分化

【Abstract】 Objective：To observe the epithelial-mesenchymal transition in human bronchial epithelial cells（16HBE） exposed to cigarette smoke.Method：Cells were stimulated by cigarrette smoke condensate（CSC） with different concentrations（5-50 μg/mL） for 7 days，then chosen the optimal concentration by cell counting kit-8.Western blot and Immunofluorescence method were used to estimate the expression levels of E-cad，type 1 collagen，Vimentin and MMP-9 in 16HBE induced with CSC （10 μg/mL） for 7 days.Result：16HBE manifested a morphological characteristic of loss of cell-cell contact and elongated shape，after 7 days induced with CSC.The level of E-cad downregulated in the experimental group[Western blot（0.301±0.041） vs （0.591±0.068），P<0.05].In contrast，upregulations in expression of type 1 collagen[Western blot （0.566±0.011） vs （0.272±0.020），P<0.05] and MMP-9[（0.463±0.003） vs （0.201±0.023），P<0.05] were observed in the presence of the experimental group，compared with the control group.Immunofluorescence analysis showed that after a 7-day exposure to CSC，E-cad protein was lost whereas type 1 collagen，Vimentin and MMP-9 proteins were acquired.Conclusion：CSC exposure can induce EMT-like process in human airway epithelial cells.

【Key words】 Cigarette smoke condensate； Bronchial epithelial cell； Epithelial-mesenchymal transition

First-authors address：Guangzhou First Peoples Hospital，Guangzhou 510180，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.23.008

氣道重塑是慢性阻塞性肺疾?。–hronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD）的主要病理特征和引起不可逆性氣流受限的主要原因之一[1]，其中上皮間充質轉分化（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）與氣道重構密切相關[2]，EMT通過使氣道壁中的成纖維細胞增加，從而參與氣道重構。吸煙是公認的導致COPD發(fā)病和不可逆氣流受限進展的最為重要的致病因素[3]。最近研究發(fā)現(xiàn)，香煙煙霧凝集物（Cigarette Smoke Condense，CSC）能誘導人氣道上皮細胞（Human Bronchial Epittielial Cell，16HBE）發(fā)生類似EMT的改變[4]。由此推斷，EMT可能是吸煙致COPD氣道重構的重要機制之一。CSC可能經(jīng)由EMT獲得成纖維細胞樣表型，促進氣道重構的發(fā)生發(fā)展。因此，本研究將16HBE暴露于CSC后，通過觀察其對16HBE細胞形態(tài)的影響及其EMT相關標志物表達的改變，為EMT在煙草煙霧暴露致COPD氣道重構中的可能作用進行初步研究?，F(xiàn)報道如下。endprint

1 材料與方法

1.1 實驗材料 采用由廣州醫(yī)學院實驗中心提供的人正常氣道上皮細胞株（Human Bronchial Epittielial Cell，16HBE）。美國GIBCO公司生產(chǎn)的DMEM細胞培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）。日本同仁化學研究所生產(chǎn)的細胞計數(shù)試劑盒-8（Cell Counting Kit-8，CCKit-8）試劑。Western blot發(fā)光試劑盒為美國Millipore公司產(chǎn)品，GAPDH兔源性多克隆抗體購于美國Biovision公司，E-cad、COL1及MMP-9抗體購自美國SantaCruz公司，Vimentin抗體和核染色液DEPI為Sigma公司產(chǎn)品，辣根酶標記山羊抗鼠IgG二抗及辣根酶標記山羊抗兔IgG二抗均購于北京華肽先鋒生物科技公司，Alexa Fluor488標記（綠色熒光）羊抗小鼠IgG工作液及Alexa Fluor594標記（紅色熒光）羊抗兔IgG工作液均購自美國生命公司。

1.2 實驗分組 將實驗分成兩組，對照組和實驗組。對照組為未經(jīng)任何處理的16HBE，實驗組即CSC刺激組。各組實驗至少重復3次，取其平均值。

1.3 實驗方法

1.3.1 CSC的制備 用于CSC制備的香煙由紅云紅河煙草有限公司生產(chǎn)，長為84 mm，直徑為8 mm，焦油含量12 mg/支，煙堿含量1.2 mg/支。將內附玻璃纖維濾膜（Cambridge filter pad，其粗糙面朝向過濾嘴一端）的過濾器兩邊連上膠管，一端連接一支香煙后點燃，另一端接上60 mL注射器。將吸入的煙霧有規(guī)律地推進過濾器和注射器。一共抽吸2支香煙，每支煙吸5 min，負壓吸引。抽吸完畢，卸下膜置于皿中，用1 mL移液槍將100%DMSO滴加于膜上，溶解凝聚物，滴加后搖晃25 min，用槍頭將溶解液吸盡，所得溶液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后，移入離心管中，12 000 r/min，離心5 min，棄上清，用1 mL的100%DMSO重懸后稱重（重懸前已稱得1 mL的100%DMSO質量），溶解前后DMSO質量相減，得出溶解后凝集物的質量（g）。把凝集物溶液配成10 mg/mL作為CSC原液，分裝，置于-80 ℃保存，備用。

1.3.2 CCKit-8法檢測細胞活性 進行干預前將細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，接種密度為1.5×104個/孔，使得次日進行干預時細胞融合達60%。24 h后，將細胞用磷酸鹽緩沖液洗2次，分別加入不同濃度的CSC后繼續(xù)培養(yǎng)7 d。在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，然后向培養(yǎng)板加入CCK8溶液（10 μL/每孔），放入5%CO2和37 ℃飽和濕度培養(yǎng)箱內培養(yǎng)4 h后取出，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長處測量各孔的光吸收值（OD值）。根據(jù)各個孔的OD值，計算細胞活性（%），細胞活性（%）=（實驗組OD均值-空白孔OD均值）/（對照孔OD均值-空白孔OD均值）×100%。OD值的測量精度為小數(shù)點后三位，按單因素方差分析法進行統(tǒng)計分析。

1.3.3 EMT有關指標檢測 干預前24 h將細胞接種于6孔板中，接種密度為1×105個/孔，使得次日進行干預時細胞融合達60%。加入10 μg/mL的CSC繼續(xù)培養(yǎng)7 d。Western-blot法測定：收集細胞提取蛋白，蛋白定量后，以20 μg/孔上樣，將樣本經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離膠進行分離后，將膠轉印至硝酸纖維素膜上。轉膜結束，條帶放入3%脫脂奶粉TBST（1%的Tween20-Tris緩沖液）中，放置搖床1 h即封閉結束。加入一抗前先按比例稀釋，小鼠抗人E-cad和兔抗人COL1按1∶1000用3%BSA稀釋，小鼠抗人MMP-9按1∶500用3%BSA稀釋，內參兔源性多克隆抗體GAPDH按1∶10 000用3%BSA稀釋，然后孵育4 ℃過夜。一抗孵育結束，室溫下用TBST洗4次，每次5 min，再用TBS洗1次，每次

5 min。加二抗（辣根酶標羊抗鼠IgG，1∶10 000或辣根酶標羊抗兔IgG，1∶10 000）室溫下孵育40 min，TBST和TBS洗如前，化學增敏發(fā)光法顯影。應用Image J軟件圖像分析系統(tǒng)獲得各條帶光密度值，蛋白質的相對含量以目的蛋白與內參條帶光密度的比值表示，按計量資料進行統(tǒng)計分析。細胞免疫熒光技術檢測法：將細胞接種于12孔板，刺激7 d后，將細胞取出，用PBS液洗3次，加入1∶1甲醇丙酮混合液，室溫下20 min，然后用PBS洗3次，每次5 min，加入0.5%的Triton X-100，室溫10 min；加入5% BSA液室溫30 min后，吸盡BSA封閉液，分別滴加稀釋一抗即小鼠抗人E-cad抗體（1∶50）、兔抗人COL1抗體（1∶100）、小鼠抗人Vimentin抗體（1∶50）及小鼠抗人MMP-9抗體（1∶200），

-4 ℃過夜。陰性對照組用PBS液代替上述一抗進行反應。用0.5%的Triton X-100于脫色搖床上沖洗細胞6次，每次5 min后，加入Alexa Fluor488標記（綠色熒光）羊抗小鼠IgG工作液（1∶250）或Alexa Fluor594標記（紅色熒光）的羊抗兔IgG工作液（1∶250），避光條件下室溫40 min。0.5%的Triton X-100洗同前，加入稀釋核染色液DEPI（1∶1000），室溫15 min，避光。0.5%的Triton X-100洗3次，每次5 min，取作好標記的干凈普通載玻片，其上滴加抗熒光淬滅劑（Invitrogen公司）10 μL，小心夾出爬片，細胞面朝下置于有抗淬滅劑的載玻片上，

-4 ℃避光過夜。運用Axio Imager Z2顯微掃描分析系統(tǒng)，在400倍高倍鏡視野下進行觀察。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，各組實驗至少重復3次，計量資料用（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。endprint

2 結果

2.1 不同梯度濃度CSC刺激下16HBE細胞活性檢

測 實驗第一步：首先從較寬濃度（5×10-3～50 μg/mL）

篩選出對細胞有效影響范圍濃度。由表1可見，CSC在5 μg/mL對16HBE細胞有明顯促增殖作用（F=274.61，P<0.05），在50 μg/mL對其活性有顯著抑制作用（F=94.10，P<0.05），因此進一步細化有效刺激濃度，范圍在5～50 μg/mL，刺激7 d后再行CCKit-8檢測。實驗第二步：從細化后的有效刺激濃度篩選出最佳刺激濃度。由表2可見，CSC在10 μg/mL時OD值達到峰值（F=122.69，P<0.05），在此峰值以后OD值下降（F=298.65、445.28、401.18，P<0.05），故將10 μg/mL作為最佳刺激濃度用于后續(xù)實驗研究。

2.2 CSC刺激后16HBE形態(tài)學檢測 經(jīng)倒置顯微鏡下觀察，對照組16HBE呈現(xiàn)上皮細胞典型的鋪路石狀形態(tài)，細胞間緊密連接，其形態(tài)是立體的，稍微凸起的，見圖1；而經(jīng)10 μg/mL CSC刺激7 d后，16HBE細胞間連接明顯減少，部分細胞形態(tài)發(fā)生改變，變?yōu)殚L梭形、多角形或星形，見圖2（刺激組中選取EMT樣改變最典型區(qū)域）。

2.3 CSC刺激后EMT相關標志物表達 Western blot法檢測，由表3及圖3可見：10 μg/mL 實驗組E-cad蛋白表達量（0.301±0.041）較之對照組（0.591±0.068）明顯減低，差異有統(tǒng)計學意義（F=0.462，P<0.05）；COL1蛋白表達量（0.566±0.011）較之對照組（0.272±0.020）明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（F=0.622，P<0.05）；MMP-9蛋白表達量（0.463±0.003）較之對照組（0.201±0.023）明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（F=2.974，P<0.05）。

2.4 CSC刺激后EMT相關標志物表達細胞免疫熒光技術檢測 由圖4～11可見：16HBE細胞經(jīng)10 μg/mL

CSC刺激后，與對照組相比，E-cad蛋白表達量減少（綠色熒光在胞膜著色減少），COL1蛋白表達量增加（紅色熒光在胞漿著色增加），Vimentin蛋白表達量增加（綠色熒光在胞漿著色增加），MMP-9蛋白表達量增加（綠色熒光在胞漿著色增加）。

3 討論

慢性阻塞性肺疾?。–hronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD）是一種具有氣流受限特征的可以預防和治療的疾病，氣流受限不完全可逆、呈進行性發(fā)展。氣道重構（Airway Remodeling）是COPD主要病理特點之一，結果可引起氣道阻塞和肺的彈性回縮力下降，在氣流受限中扮演非常重要的角色。COPD氣道重塑的特征包括鱗狀和杯狀細胞的化生、黏液腺的肥大和上皮下的纖維化，其中以纖維化為最主要病變[5]。

吸煙已被公認為COPD發(fā)病的一個重要危險因素。一般認為，煙草煙霧進入氣道后首先引起氣道上皮的防御反應，導致許多炎癥細胞（如巨噬細胞、中性粒細胞、CD8+T細胞、上皮細胞等）的集聚活化，并通過自分泌和旁分泌方式釋放各種細胞因子、炎癥因子和介質和蛋白酶作用于氣道結構細胞，引起氣道結構細胞的形態(tài)和功能的變化。最近研究指出，在吸煙的COPD患者中，其氣道網(wǎng)狀基底膜斷裂較之不吸煙的正常對照更為明顯，上皮細胞穿過斷裂的基底膜并分化成為肌纖維細胞[6]，然而關于CSC通過何種機制誘導上皮細胞發(fā)生纖維化，從而參與COPD氣道重構的研究甚少。

上皮間充質轉化（EMT）是指在胚胎發(fā)育、腫瘤轉移或組織纖維化過程中發(fā)生的上皮細胞脫黏附而轉變成具遷移能力的間質細胞的現(xiàn)象[7-9]。其病理變化主要包括破壞后缺陷的上皮修復、過多的纖維細胞和肌纖維母細胞，膠原的過度產(chǎn)生和纖維化的發(fā)生[10]。EMT作為COPD氣道重塑的重要機制之一，近年來越來越受到重視[11-14]。其與肺纖維化關系密切，是肺纖維化局部成纖維細胞的重要來源[15]。由于EMT，上皮細胞轉化為活動的成纖維細胞，進一步發(fā)展成為肌成纖維細胞，使纖維細胞數(shù)量增加[2]，從而參與氣道重構。最近報道指出，CSC能誘導人氣道上皮細胞發(fā)生類似EMT的改變[4]。體外實驗證實，在CSC刺激下，A549（人肺腺癌細胞）能夠呈現(xiàn)轉分化表型[16]。最近研究報道，香煙煙霧提取物可誘導正常人支氣管上皮細胞（BEAS-2B）發(fā)生EMT[17]。由此推測，CSC可能誘導人氣道上皮細胞發(fā)生EMT樣改變，從而使氣道上皮細胞獲得成纖維細胞樣表型，促進氣道重構發(fā)展。因此，EMT可能是吸煙致COPD氣道結構重構的重要機制之一。

正常的上皮細胞表型具有結構和功能上的極性，細胞之間緊密連接，其中E鈣黏蛋白（E-cadherin）是粘附連接的主要成分，特別是上皮細胞的連接[18]。在EMT過程中，細胞與細胞間接觸減少，細胞的連接被拆卸，E鈣黏蛋白從細胞連接中移位，表達減少，F(xiàn)-肌動蛋白和β-連環(huán)蛋白連接減少，細胞角蛋白丟失，出現(xiàn)間充質和肌成纖維細胞特有標志如波形蛋白、α-平滑肌肌動蛋白等[19]。在纖維化過程中，細胞外基質（ECM）形成和降解的生理學平衡被打亂，與基質流動和生長因子激活有關的基質金屬蛋白酶（如MMP-2、MMP-9）均顯示上調[20]。本研究選擇幾個有代表性的，與EMT改變密切相關的指標（如MMP-9、1型膠原）進行檢測，從研究結果可以看出，煙草煙霧暴露于人氣道上皮細胞（16HBE）后，能刺激其發(fā)生類似EMT的改變，這與文獻[4]的報道一致。刺激后的16HBE雖然沒有真正成為成纖維細胞，但從其形態(tài)變化、EMT標志物表達變化上分析，整體傾向于向成纖維細胞發(fā)展。然而，人體是一個復雜的有機體，而EMT又是一非常復雜的過程，上皮細胞短期暴露不可能完全轉變?yōu)槌衫w維細胞，所以在本研究中只能看到其向成纖維細胞改變的趨勢。由此，進一步開展其體內試驗的研究非常有必要。本實驗表明，CSC刺激16HBE細胞7 d后，無論是細胞形態(tài)還是基因表達都向EMT樣的改變發(fā)展，標記物表達與細胞形態(tài)學改變均符合EMT樣的轉變，這可能為香煙煙霧暴露致COPD氣道重塑的發(fā)病機制提供線索。但由于香煙及其煙霧中含有3800多種化合物，其有害物質組分復雜，關于煙草煙霧何種成分在其中發(fā)揮主要作用，研究甚少。尼古丁是煙草中的主要致成癮成分，且在香煙煙霧中的含量較高，最近有研究推測[21]，尼古丁可能通過誘導上皮細胞轉分化參與吸煙所致COPD患者氣道重構，因此關于其有害成分的體外試驗研究仍有待進一步開展。endprint

參考文獻

[1] Berg K，Wright J L.The Pathology of Chronic Obstructive Pulmonary Disease：Progress in the 20th and 21st Centuries[J].Arch Pathol Lab Med，2016，140（12）：1423-1428.

[2] C?mara J，Jarai G.Epithelial-mesenchymal transition in primary human bronchial epithelial cells is Smad-dependent and enhanced by fibronectin and TNF-α[J].Fibrogenesis Tissue Repair，2010，3（1）：2-3.

[3] Pauwels R A，Buist A S，Calverley P M，et al.Global strategy for the diagnosis，management，and prevention of chronic obstructive pulmonary disease.NHLBI/WHO Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease（GOLD） Workshop summary[J].American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine，2001，163（5）：1256-1276.

[4] Veljkovic E，Jiricny J，Menigatti M，et al.Chronic exposure to cigarette smoke condensate in vitro induces epithelial to mesenchymal transition-like changes in human bronchial epithelial cells，BEAS-2B[J].Toxicol In Vitro，2011，25（2）：446-453.

[5] Salazar L M，Herrera A M.Fibrotic response of tissue remodeling in COPD[J].Lung，2011，189（2）：101-109.

[6] Sohal S S，Reid D，Soltani A，et al.Reticular basement membrane fragmentation and potential epithelial mesenchymal transition is exaggerated in the airways of smokers with chronic obstructive pulmonary disease[J].Respirolog，2010，15（6）：930-938.

[7] Micalizzi D S，F(xiàn)arabaugh S M， Ford H L.Epithelial-mesenchymal transition in cancer：parallels between normal development and tumor progression[J].Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia，2010，15（2）：117-134.

[8] Zhao R Z，Wu Z H，Zhou Q H.Epithelial-mesenchymal transition and tumor metastasis[J].Chin J Lung Cancer，2011，14（7）：620-624.

[9] Hay E D.The mesenchymal cell，its role in the embryo，and the remarkable signaling mechanisms that create it[J].Dev Dyn，2005，233（3）：706-720.

[10] Gumbiner B M.Regulation of cadherin adhesive activity[J].J Cell Biol，2000，148（3）：399-404.

[11]李竹，劉建英.上皮-間充質轉化在慢性阻塞性肺疾病中的研究進展[J].實用醫(yī)學雜志，2016，32（5）：695-697.

[12] Nowrin K，Sohal S S，Peterson G，et al.Epithelial-mesenchymal transition as a fundamental underlying pathogenic process in COPD airways：fibrosis，remodeling and cancer[J].Expert Rev Respir Med，2014，8（5）：547-559.

[13] Sohal S S，Walters E H.Epithelial mesenchymal transition（EMT） in small airways of COPD patients[J].Thorax，2013，68（8）：783-784.

[14]吳海蘭，辛曉峰.上皮間充質轉化與慢性阻塞性肺疾病的氣道重塑[J].醫(yī)學研究生學報，2015，28（9）：1004-1008.

[15] Willis B C，duBois R M， Borok Z.Epithelial origin of myofibroblasts during fibrosis in the lung[J].Proc Am Thorac Soc，2006，3（4）：377-382.endprint

[16] Liu Y，Gao W，Zhang D.Effects of cigarette smoke extract on A549 cells and human lung fibroblasts treated with transforming growth factor-beta1 in a coculture system[J].Clin Exp Med，2010，10（3）：159-167.

[17]劉振峰，劉建英，劉代順，等.香煙煙霧提取物誘導呼吸道上皮細胞間質性轉化的實驗研究[J].重慶醫(yī)學，2017，46（3）：318-321.

[18] Cui Y F，Zhang K G.Advance in relationship between E-cadherin and gastric cancer[J].Chin J Gastroenterol Hepatol，2013，22（9）：833-835.

[19] Tian M Y，Wang L H，Zhang X，et al.Expressions of E-cadherin and Vimentin in lung cancer tissue and their relationship with epithelial-mesenchymal transition[J].Chin J Biologicals，2011，24（9）：1068-1071.

[20] Oggionni T，Morbini P，Inghilleri S，et al.Time course of matrix metalloproteases and tissue inhibitors in bleomycin-induced pulmonary fibrosis[J].Eur J Histochem，2006，50（4）：317-325.

[21] Zou W，Zou Y，Zhao Z，et al.Nicotine-induced epithelial-mesenchymal transition via Wnt/β-catenin signaling in human airway epithelial cells[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2013，304（4）：199-209.

（收稿日期：2017-03-27） （本文編輯：程旭然）endprint