張笑春,王瑛華,陳 剛
(肇慶學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,廣東肇慶 526061)
變形桿菌(Proteeae)是一類大小、形態(tài)不一的細(xì)菌,有時(shí)呈球形,有時(shí)呈絲狀,具有明顯的多形性;周身鞭毛,能運(yùn)動(dòng)且運(yùn)動(dòng)活潑;無芽孢莢膜,需氧及兼性厭氧,為革蘭氏陰性菌,屬于腸桿菌科。變形桿菌病是各種動(dòng)物均易感的一種傳染病。水貂變形桿菌病主要由變形桿菌屬細(xì)菌引起。近年來,不斷有各種禽類、鹿、熊貓等動(dòng)物感染變形桿菌的報(bào)道[1-4],同時(shí)也有變形桿菌感染水貂引起發(fā)病的相關(guān)報(bào)道[5-6]。
2015年3月某水貂養(yǎng)殖場(chǎng)的水貂每天死亡4~8只。病貂死亡前出現(xiàn)氣喘,口吐血水、血沫,下痢等癥狀。用青霉素和土霉素對(duì)發(fā)病水貂進(jìn)行治療,未見好轉(zhuǎn)。剖檢病死貂,可見肺臟多為紫紅色,有大量出血點(diǎn),肺臟、氣管切開后有泡沫狀血水;胸腔大量積液,心臟、心包膜有出血點(diǎn);腸道呈彌散性出血。經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查、臨床診斷、病理剖檢、實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn),鑒定為變形桿菌病?,F(xiàn)將對(duì)該病例的診斷和治療報(bào)告如下。
病料來自畜主送檢的水貂(貂場(chǎng)規(guī)模500只)。無菌條件下,取心、肝、脾、肺、腎等病變明顯的內(nèi)臟組織樣品,4 ℃冷藏備用。
鮮血瓊脂培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、十六烷瓊脂培養(yǎng)基:按常規(guī)方法配置并滅菌,在無菌條件下制成平板培養(yǎng)基;大豆肉湯培養(yǎng)基:按常規(guī)方法配制[7];革蘭氏染色液和細(xì)菌生化微量鑒定管:購自杭州天和微生物試劑有限公司。
12只健康昆明小白鼠(4周齡、平均體重20 g)。
使用犬瘟熱病毒快速檢測(cè)試紙、犬細(xì)小病毒快速檢測(cè)試紙條(韓國(guó)安捷公司)進(jìn)行檢測(cè)。嚴(yán)格按照生產(chǎn)商說明書,垂直滴加4滴無氣泡樣本混合液于試紙卡加樣孔(S)內(nèi),開始計(jì)時(shí)。陽性結(jié)果為:除質(zhì)控區(qū)(C)外,另有1條粉紅色帶出現(xiàn)在檢測(cè)區(qū)(T)。陽性結(jié)果表示加入樣本中含有犬瘟熱或犬細(xì)小病毒抗原。
在無菌條件下,對(duì)水貂病變部位進(jìn)行涂片、鏡檢;發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌存在后,用滅菌接種環(huán)挑取病死水貂的病變部位,接種于十六烷瓊脂平板、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱平板、全血瓊脂平板,37 ℃培養(yǎng)1 d;挑取單個(gè)菌落涂片,革蘭氏染色后鏡檢。
各種糖(醇)發(fā)酵試驗(yàn):在無菌條件下,用接種針將分離的細(xì)菌接種到發(fā)酵微量管中,恒溫置于生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 d后,觀察結(jié)果并記錄。
其他試驗(yàn):按常規(guī)方法分別進(jìn)行脲酶試驗(yàn)、觸酶試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、MR試驗(yàn)和VP試驗(yàn)。
按姚火春[8]的圓紙片擴(kuò)散法,即用滅菌棉球擦拭涂布器后,蘸取純培養(yǎng)物制成的細(xì)菌懸液,均勻涂布于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂表面,蓋好平皿;在室溫干燥5 min,待平板表面稍干即可放置藥敏片;用滅菌鑷子無菌操作取出藥敏片,貼在涂有細(xì)菌的平板培養(yǎng)基表面[9],于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)16~18 h,觀察結(jié)果。
將體重為20 g左右的12只健康小鼠隨機(jī)分為2組,分別是攻毒組、空白對(duì)照組,每組6只。攻毒組小鼠腹腔注射0.2 mL109cfu 的變形桿菌肉湯稀釋液;空白對(duì)照組小鼠腹腔注射0.2 mL無菌肉湯液。連續(xù)觀察2 d,記錄小鼠的存活情況;剖檢死亡小鼠觀察病變,并取心臟、肝臟進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。
犬瘟熱與犬細(xì)小病毒檢測(cè)均為陰性;除質(zhì)控區(qū)(C)外,未見有粉紅色帶出現(xiàn)在檢測(cè)區(qū)(T),說明病貂體內(nèi)不含有犬瘟熱與犬細(xì)小病毒。
經(jīng)染色鏡檢可見革蘭氏陰性、單個(gè)或成對(duì)的球桿狀、長(zhǎng)絲狀或短鏈狀多形性桿菌;以桿狀為主,多為單個(gè)存在,無芽胞和莢膜。
該菌在十六烷瓊脂培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好,呈薄膜狀擴(kuò)散、厚薄交替呈層層波狀的同心環(huán)樣菌苔。在普通瓊脂平板上形成半透明、光滑菌落,邊緣有遷徙生長(zhǎng)現(xiàn)象。在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上有薄膜樣菌落生成,無溶血現(xiàn)象。在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上有半透明、光滑、粉色菌落。
該菌經(jīng)培養(yǎng)后可以分解葡萄糖、乳糖、木糖;甘露醇、硫化氫、脲酶、觸酶、MR、苯丙氨酸、半乳糖、甘露醇試驗(yàn)陽性(在種間有不同的反應(yīng))。這些與變形桿菌的生化特性基本相符(表1)。
表1 生化試驗(yàn)結(jié)果
通過藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),該菌對(duì)丙氟哌酸及奧復(fù)星敏感,對(duì)阿米卡星中等敏感,對(duì)其他藥物不敏感(表2)??咕幬锏囊志h(huán)與敏感標(biāo)準(zhǔn)見表3。
表2 分離菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果
表3 抗菌藥物的抑菌環(huán)與敏感標(biāo)準(zhǔn)
攻毒組,注射3 h后小鼠出現(xiàn)呼吸急促、腹瀉、陣痛、精神沉郁等癥狀,1 d內(nèi)小鼠無死亡;撲殺剖檢其中3只,可見小鼠脾臟腫大,肝臟發(fā)黃,腸道水腫、臌氣;從肝臟、心臟中均分離出變形桿菌;1~2 d內(nèi)有3只小鼠死亡??瞻讓?duì)照組,6只小鼠在2 d內(nèi)無異常反應(yīng);撲殺后分離不到任何細(xì)菌。經(jīng)生化試驗(yàn)、細(xì)菌學(xué)試驗(yàn)鑒定,證實(shí)小鼠體內(nèi)分離的細(xì)菌和從水貂體內(nèi)分離的細(xì)菌是同一種菌。
變形桿菌是一種食源性條件致病菌,是腸道內(nèi)正常菌群,廣泛存在于水、泥土和被糞便污染的物質(zhì)之中,一般情況下不致病,但在特殊條件下可引起動(dòng)物發(fā)病,是引起醫(yī)源性感染的重要條件致病菌,在臨床上常為混合感染或繼發(fā)感染。近年來,該菌在發(fā)病水貂體內(nèi)經(jīng)常分離到,給廣大養(yǎng)殖戶造成很大經(jīng)濟(jì)損失,因此應(yīng)引起水貂養(yǎng)殖業(yè)的高度重視。水貂感染變形桿菌的典型病理變化是肺臟淤血,呈鮮紅色,個(gè)別邊緣壞死,胸腔大量積液,心臟、心包膜有出血點(diǎn);腸道呈彌散性出血;腸系膜淋巴結(jié)腫大,脾臟呈深紅色,上有淤血斑,腎臟呈深紅色,上有出血斑,甚至化膿灶。本病例中患病水貂癥狀與該病的典型癥狀基本一致。
接診病例時(shí),應(yīng)以淺顯明確的問訊方式向畜主了解情況。首先要了解貂場(chǎng)情況、發(fā)病史、免疫情況,然后對(duì)飼養(yǎng)水平做出基本判斷。正常情況下變形桿菌屬致病機(jī)理主要有以下兩個(gè)方面:(1)由于機(jī)體防衛(wèi)功能減弱,引起自身感染;(2)由于正常菌群寄居部位改變,發(fā)生了定位轉(zhuǎn)移,引起疾病[10]。所以,消除誘發(fā)因素是防治變形桿菌病的重要手段。
針對(duì)水貂變形桿菌病,使用土霉素對(duì)發(fā)病水貂養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行大群投喂,在遼寧省的效果不明顯,后改用喹乙醇,每只每次30 mg入飼料中投喂,2次/d,3~4 d后病情得到控制[11]。在藥敏試驗(yàn)中,四環(huán)素對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)抑制和殺滅作用不明顯,因此臨床使用土霉素對(duì)發(fā)病水貂的治療效果不佳。在使用藥物治療細(xì)菌病時(shí),最好先進(jìn)行藥敏試驗(yàn),再選擇對(duì)該菌敏感的藥物進(jìn)行治療。這樣既可以節(jié)省成本,縮短治療時(shí)間,亦可達(dá)到良好的治療效果。根據(jù)本試驗(yàn)中的藥敏試驗(yàn)結(jié)果及各地區(qū)用藥治療情況,對(duì)該病例采用口服丙氟哌酸和補(bǔ)液鹽,在飲水中加入適量水溶性維生素,投服葡萄糖粉和維生素E粉等措施,病情得到基本控制。在用藥期間要注意飼喂優(yōu)質(zhì)且易于消化的飼料,補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng),若水貂下痢嚴(yán)重,要注意補(bǔ)充電解質(zhì)。
同時(shí)應(yīng)做好消毒隔離工作,避免病菌擴(kuò)散。將病死貂和撲殺的病重貂深埋,清除養(yǎng)殖舍內(nèi)糞便并集中燒毀;對(duì)貂舍、飼具,用百毒殺消毒藥水噴灑消毒或用3%~5%來蘇兒、10%石灰乳、15%漂白粉進(jìn)行消毒;舍外則選用20 g/ L 的燒堿噴灑消毒,以達(dá)到徹底消滅病原菌的目的;嚴(yán)禁非飼養(yǎng)人員不經(jīng)防護(hù)隨便進(jìn)出貂舍,以防止疾病傳入。
據(jù)了解,水貂發(fā)病前,水貂養(yǎng)殖場(chǎng)所在地區(qū)出現(xiàn)了暴雨天氣,加上飼養(yǎng)場(chǎng)內(nèi)排水不暢,出現(xiàn)大量積水,飼料也進(jìn)行了更換,所以環(huán)境因素及飼料的變更是這次疾病暴發(fā)的重要原因。變形桿菌廣泛存在于水、土壤中的腐敗有機(jī)物,以及人和動(dòng)物的腸道中,為條件致病菌,多為繼發(fā)感染。因此,做好飼料衛(wèi)生,加強(qiáng)日常飼養(yǎng)管理,對(duì)于預(yù)防本病的發(fā)生具有重要作用。在飼養(yǎng)中,飼養(yǎng)員應(yīng)注意觀察水貂的飲食和健康狀況,保證飼料營(yíng)養(yǎng)全面,以免因營(yíng)養(yǎng)不均衡造成機(jī)體抵抗力下降而引發(fā)疾病。
本試驗(yàn)通過細(xì)菌分離培養(yǎng)、細(xì)菌生化試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)及動(dòng)物試驗(yàn),同時(shí)進(jìn)行病毒檢測(cè),最終診斷致病菌為變形桿菌。該病多以嘔吐、腹瀉為主要臨床癥狀,病理變化多呈現(xiàn)全身性出血性敗血癥表現(xiàn)。隨后通過藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)變形桿菌對(duì)丙氟哌酸和奧復(fù)星敏感,對(duì)阿米卡星中等敏感。本次治療采用對(duì)該菌最為敏感的丙氟哌酸進(jìn)行治療,配合補(bǔ)液,最終達(dá)到了良好的治療效果。
[1] 虞德屏,陽艷,朱夢(mèng)代,等. 肉雞奇異變形桿菌病的診斷與治療[J]. 中國(guó)家禽,2005,27(10):23.
[2] 許海峰. 雛雞奇異變形桿菌病的診斷[J]. 中國(guó)畜禽傳染病,1997,96(5):45-46.
[3] 陳武. 鹿科動(dòng)物奇異變形桿菌病的診治[J]. 中國(guó)獸醫(yī)雜志,2002,38(5):28-29.
[4] 陳武,黃勉,桑青芳. 小熊貓奇異變形桿菌病的診治[J]. 畜牧與獸醫(yī),2003,35(9):28-29.
[5] 胡傳偉,賈赟,簡(jiǎn)中友,等. 水貂奇異變形桿菌的分離與鑒定[J]. 經(jīng)濟(jì)動(dòng)物學(xué)報(bào),2006,10(2):77-79.
[6] 王建科,程悅寧,易立,等. 水貂奇異變形桿菌的分離鑒定及16S rRNA基因序列分析[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2015,42(4):852-858.
[7] 陸承平. 獸醫(yī)微生物學(xué)[M]. 3版. 北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2004:248-254.
[8] 姚火春. 獸醫(yī)微生物學(xué)試驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 2版. 北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2002:19-21.
[9] 洪秀華. 臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)[M]. 北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2004:140-145.
[10] 畢水蓮,李琳,唐書澤,等. 變形桿菌屬食物中毒的特點(diǎn)與防控措施[J]. 現(xiàn)代食品科技,2009,25(6):690-695.
[11] 王鵬. 一種耐藥變形桿菌的分離、鑒定及其免疫學(xué)效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,30(8):51-53.