水貂變形桿菌病的檢測(cè)與防治

張笑春，王瑛華，陳 剛

（肇慶學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東肇慶 526061）

變形桿菌（Proteeae）是一類大小、形態(tài)不一的細(xì)菌，有時(shí)呈球形，有時(shí)呈絲狀，具有明顯的多形性；周身鞭毛，能運(yùn)動(dòng)且運(yùn)動(dòng)活潑；無芽孢莢膜，需氧及兼性厭氧，為革蘭氏陰性菌，屬于腸桿菌科。變形桿菌病是各種動(dòng)物均易感的一種傳染病。水貂變形桿菌病主要由變形桿菌屬細(xì)菌引起。近年來，不斷有各種禽類、鹿、熊貓等動(dòng)物感染變形桿菌的報(bào)道[1-4]，同時(shí)也有變形桿菌感染水貂引起發(fā)病的相關(guān)報(bào)道[5-6]。

2015年3月某水貂養(yǎng)殖場(chǎng)的水貂每天死亡4～8只。病貂死亡前出現(xiàn)氣喘，口吐血水、血沫，下痢等癥狀。用青霉素和土霉素對(duì)發(fā)病水貂進(jìn)行治療，未見好轉(zhuǎn)。剖檢病死貂，可見肺臟多為紫紅色，有大量出血點(diǎn)，肺臟、氣管切開后有泡沫狀血水；胸腔大量積液，心臟、心包膜有出血點(diǎn)；腸道呈彌散性出血。經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查、臨床診斷、病理剖檢、實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)，鑒定為變形桿菌病?，F(xiàn)將對(duì)該病例的診斷和治療報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 被檢病料

病料來自畜主送檢的水貂（貂場(chǎng)規(guī)模500只）。無菌條件下，取心、肝、脾、肺、腎等病變明顯的內(nèi)臟組織樣品，4 ℃冷藏備用。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

鮮血瓊脂培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、十六烷瓊脂培養(yǎng)基：按常規(guī)方法配置并滅菌，在無菌條件下制成平板培養(yǎng)基；大豆肉湯培養(yǎng)基：按常規(guī)方法配制[7]；革蘭氏染色液和細(xì)菌生化微量鑒定管：購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

12只健康昆明小白鼠（4周齡、平均體重20 g）。

1.4 犬瘟熱和犬細(xì)小病毒檢測(cè)

使用犬瘟熱病毒快速檢測(cè)試紙、犬細(xì)小病毒快速檢測(cè)試紙條（韓國(guó)安捷公司）進(jìn)行檢測(cè)。嚴(yán)格按照生產(chǎn)商說明書，垂直滴加4滴無氣泡樣本混合液于試紙卡加樣孔（S）內(nèi)，開始計(jì)時(shí)。陽性結(jié)果為：除質(zhì)控區(qū)（C）外，另有1條粉紅色帶出現(xiàn)在檢測(cè)區(qū)（T）。陽性結(jié)果表示加入樣本中含有犬瘟熱或犬細(xì)小病毒抗原。

1.5 細(xì)菌分離與鏡檢

在無菌條件下，對(duì)水貂病變部位進(jìn)行涂片、鏡檢；發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌存在后，用滅菌接種環(huán)挑取病死水貂的病變部位，接種于十六烷瓊脂平板、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱平板、全血瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)1 d；挑取單個(gè)菌落涂片，革蘭氏染色后鏡檢。

1.6 細(xì)菌鑒定

各種糖（醇）發(fā)酵試驗(yàn)：在無菌條件下，用接種針將分離的細(xì)菌接種到發(fā)酵微量管中，恒溫置于生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 d后，觀察結(jié)果并記錄。

其他試驗(yàn)：按常規(guī)方法分別進(jìn)行脲酶試驗(yàn)、觸酶試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、MR試驗(yàn)和VP試驗(yàn)。

1.7 藥敏試驗(yàn)

按姚火春[8]的圓紙片擴(kuò)散法，即用滅菌棉球擦拭涂布器后，蘸取純培養(yǎng)物制成的細(xì)菌懸液，均勻涂布于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂表面，蓋好平皿；在室溫干燥5 min，待平板表面稍干即可放置藥敏片；用滅菌鑷子無菌操作取出藥敏片，貼在涂有細(xì)菌的平板培養(yǎng)基表面[9]，于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)16～18 h，觀察結(jié)果。

1.8 動(dòng)物試驗(yàn)

將體重為20 g左右的12只健康小鼠隨機(jī)分為2組，分別是攻毒組、空白對(duì)照組，每組6只。攻毒組小鼠腹腔注射0.2 mL109cfu 的變形桿菌肉湯稀釋液；空白對(duì)照組小鼠腹腔注射0.2 mL無菌肉湯液。連續(xù)觀察2 d，記錄小鼠的存活情況；剖檢死亡小鼠觀察病變，并取心臟、肝臟進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 病毒檢測(cè)

犬瘟熱與犬細(xì)小病毒檢測(cè)均為陰性；除質(zhì)控區(qū)（C）外，未見有粉紅色帶出現(xiàn)在檢測(cè)區(qū)（T），說明病貂體內(nèi)不含有犬瘟熱與犬細(xì)小病毒。

2.2 細(xì)菌形態(tài)

經(jīng)染色鏡檢可見革蘭氏陰性、單個(gè)或成對(duì)的球桿狀、長(zhǎng)絲狀或短鏈狀多形性桿菌；以桿狀為主，多為單個(gè)存在，無芽胞和莢膜。

2.3 分離培養(yǎng)

該菌在十六烷瓊脂培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，呈薄膜狀擴(kuò)散、厚薄交替呈層層波狀的同心環(huán)樣菌苔。在普通瓊脂平板上形成半透明、光滑菌落，邊緣有遷徙生長(zhǎng)現(xiàn)象。在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上有薄膜樣菌落生成，無溶血現(xiàn)象。在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上有半透明、光滑、粉色菌落。

2.4 生化試驗(yàn)

該菌經(jīng)培養(yǎng)后可以分解葡萄糖、乳糖、木糖；甘露醇、硫化氫、脲酶、觸酶、MR、苯丙氨酸、半乳糖、甘露醇試驗(yàn)陽性（在種間有不同的反應(yīng)）。這些與變形桿菌的生化特性基本相符（表1）。

表1 生化試驗(yàn)結(jié)果

2.5 藥敏試驗(yàn)

通過藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該菌對(duì)丙氟哌酸及奧復(fù)星敏感，對(duì)阿米卡星中等敏感，對(duì)其他藥物不敏感（表2）?？咕幬锏囊志h(huán)與敏感標(biāo)準(zhǔn)見表3。

表2 分離菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

表3 抗菌藥物的抑菌環(huán)與敏感標(biāo)準(zhǔn)

2.6 動(dòng)物試驗(yàn)

攻毒組，注射3 h后小鼠出現(xiàn)呼吸急促、腹瀉、陣痛、精神沉郁等癥狀，1 d內(nèi)小鼠無死亡；撲殺剖檢其中3只，可見小鼠脾臟腫大，肝臟發(fā)黃，腸道水腫、臌氣；從肝臟、心臟中均分離出變形桿菌；1～2 d內(nèi)有3只小鼠死亡?？瞻讓?duì)照組，6只小鼠在2 d內(nèi)無異常反應(yīng)；撲殺后分離不到任何細(xì)菌。經(jīng)生化試驗(yàn)、細(xì)菌學(xué)試驗(yàn)鑒定，證實(shí)小鼠體內(nèi)分離的細(xì)菌和從水貂體內(nèi)分離的細(xì)菌是同一種菌。

3 討論

3.1 水貂變形桿菌病的病理變化特點(diǎn)

變形桿菌是一種食源性條件致病菌，是腸道內(nèi)正常菌群，廣泛存在于水、泥土和被糞便污染的物質(zhì)之中，一般情況下不致病，但在特殊條件下可引起動(dòng)物發(fā)病，是引起醫(yī)源性感染的重要條件致病菌，在臨床上常為混合感染或繼發(fā)感染。近年來，該菌在發(fā)病水貂體內(nèi)經(jīng)常分離到，給廣大養(yǎng)殖戶造成很大經(jīng)濟(jì)損失，因此應(yīng)引起水貂養(yǎng)殖業(yè)的高度重視。水貂感染變形桿菌的典型病理變化是肺臟淤血，呈鮮紅色，個(gè)別邊緣壞死，胸腔大量積液，心臟、心包膜有出血點(diǎn)；腸道呈彌散性出血；腸系膜淋巴結(jié)腫大，脾臟呈深紅色，上有淤血斑，腎臟呈深紅色，上有出血斑，甚至化膿灶。本病例中患病水貂癥狀與該病的典型癥狀基本一致。

3.2 初步診斷注意事項(xiàng)

接診病例時(shí)，應(yīng)以淺顯明確的問訊方式向畜主了解情況。首先要了解貂場(chǎng)情況、發(fā)病史、免疫情況，然后對(duì)飼養(yǎng)水平做出基本判斷。正常情況下變形桿菌屬致病機(jī)理主要有以下兩個(gè)方面：（1）由于機(jī)體防衛(wèi)功能減弱，引起自身感染；（2）由于正常菌群寄居部位改變，發(fā)生了定位轉(zhuǎn)移，引起疾病[10]。所以，消除誘發(fā)因素是防治變形桿菌病的重要手段。

3.3 藥物治療與藥敏試驗(yàn)

針對(duì)水貂變形桿菌病，使用土霉素對(duì)發(fā)病水貂養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行大群投喂，在遼寧省的效果不明顯，后改用喹乙醇，每只每次30 mg入飼料中投喂，2次/d，3～4 d后病情得到控制[11]。在藥敏試驗(yàn)中，四環(huán)素對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)抑制和殺滅作用不明顯，因此臨床使用土霉素對(duì)發(fā)病水貂的治療效果不佳。在使用藥物治療細(xì)菌病時(shí)，最好先進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，再選擇對(duì)該菌敏感的藥物進(jìn)行治療。這樣既可以節(jié)省成本，縮短治療時(shí)間，亦可達(dá)到良好的治療效果。根據(jù)本試驗(yàn)中的藥敏試驗(yàn)結(jié)果及各地區(qū)用藥治療情況，對(duì)該病例采用口服丙氟哌酸和補(bǔ)液鹽，在飲水中加入適量水溶性維生素，投服葡萄糖粉和維生素E粉等措施，病情得到基本控制。在用藥期間要注意飼喂優(yōu)質(zhì)且易于消化的飼料，補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)，若水貂下痢嚴(yán)重，要注意補(bǔ)充電解質(zhì)。

同時(shí)應(yīng)做好消毒隔離工作，避免病菌擴(kuò)散。將病死貂和撲殺的病重貂深埋，清除養(yǎng)殖舍內(nèi)糞便并集中燒毀；對(duì)貂舍、飼具，用百毒殺消毒藥水噴灑消毒或用3%～5%來蘇兒、10%石灰乳、15%漂白粉進(jìn)行消毒；舍外則選用20 g/ L 的燒堿噴灑消毒，以達(dá)到徹底消滅病原菌的目的；嚴(yán)禁非飼養(yǎng)人員不經(jīng)防護(hù)隨便進(jìn)出貂舍，以防止疾病傳入。

3.4 預(yù)防措施

據(jù)了解，水貂發(fā)病前，水貂養(yǎng)殖場(chǎng)所在地區(qū)出現(xiàn)了暴雨天氣，加上飼養(yǎng)場(chǎng)內(nèi)排水不暢，出現(xiàn)大量積水，飼料也進(jìn)行了更換，所以環(huán)境因素及飼料的變更是這次疾病暴發(fā)的重要原因。變形桿菌廣泛存在于水、土壤中的腐敗有機(jī)物，以及人和動(dòng)物的腸道中，為條件致病菌，多為繼發(fā)感染。因此，做好飼料衛(wèi)生，加強(qiáng)日常飼養(yǎng)管理，對(duì)于預(yù)防本病的發(fā)生具有重要作用。在飼養(yǎng)中，飼養(yǎng)員應(yīng)注意觀察水貂的飲食和健康狀況，保證飼料營(yíng)養(yǎng)全面，以免因營(yíng)養(yǎng)不均衡造成機(jī)體抵抗力下降而引發(fā)疾病。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過細(xì)菌分離培養(yǎng)、細(xì)菌生化試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)及動(dòng)物試驗(yàn)，同時(shí)進(jìn)行病毒檢測(cè)，最終診斷致病菌為變形桿菌。該病多以嘔吐、腹瀉為主要臨床癥狀，病理變化多呈現(xiàn)全身性出血性敗血癥表現(xiàn)。隨后通過藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)變形桿菌對(duì)丙氟哌酸和奧復(fù)星敏感，對(duì)阿米卡星中等敏感。本次治療采用對(duì)該菌最為敏感的丙氟哌酸進(jìn)行治療，配合補(bǔ)液，最終達(dá)到了良好的治療效果。

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