胡騰惠 徐興祥

端粒是位于真核生物染色體末端的線性結(jié)構(gòu)，具有抑制染色體末端進(jìn)行重組及融合的功能，從而維持染色體的穩(wěn)定性，端粒在細(xì)胞復(fù)制的過程中會(huì)不斷縮短，而端粒酶能夠維持端粒長(zhǎng)度，從而促使細(xì)胞不斷進(jìn)行復(fù)制[1]。研究表明，超過90%的惡性腫瘤具有端粒酶活性，而在正常細(xì)胞與組織中，則只能在淋巴細(xì)胞、造血細(xì)胞、生殖細(xì)胞等具有增殖潛能的細(xì)胞中檢測(cè)到端粒酶活性[2-4]。這就充分表明端粒酶可以作為一種腫瘤分子標(biāo)志物來進(jìn)行廣泛應(yīng)用。非整倍體是指?jìng)€(gè)別染色體減少或增加一條或幾條而導(dǎo)致染色體數(shù)目非整倍數(shù)，所以稱為非整倍體，是細(xì)胞分裂時(shí)染色體分離、染色體丟失、染色體易位異常的結(jié)果。非整倍體嚴(yán)重威脅人類的健康：某些先天性畸形綜合征、自發(fā)性流產(chǎn)、死胎形成的主要原因就同非整倍體相關(guān)，90%的實(shí)體瘤和50%的血液腫瘤也是非整倍體所致[5]。研究發(fā)現(xiàn)，端粒酶及非整倍體在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，但端粒酶在整倍體與非整倍體細(xì)胞中的表達(dá)是否具有差異，端粒酶抑制劑疊氮脫氧胸苷(azidothymidine, AZT)對(duì)整倍體和非整倍體細(xì)胞端粒酶hTERT基因的表達(dá)及活性有何影響，目前尚不清楚，本研究擬對(duì)這些問題進(jìn)行探討。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

人HCT116細(xì)胞來源于蘇北醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心，胎牛血清購(gòu)于杭州四季青公司，AZT購(gòu)于TCI公司，鹽酸強(qiáng)力霉素及吉姆薩染液購(gòu)于索萊寶公司，nocodazole及Eukitt? 快速硬化封片劑購(gòu)于sigma公司，MG132購(gòu)于selleckchem公司，端粒酶活性試劑盒購(gòu)于Roche公司，MAD2L1購(gòu)于R&D Systems公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

取人HCT 116細(xì)胞培養(yǎng)于含10%滅活胎牛血清、100 U/ml青鏈霉素DMEM 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT116細(xì)胞加入1/1 000的0.2 mg/ml 鹽酸強(qiáng)力霉素(doxycycline)，作用16 h后，撤掉鹽酸強(qiáng)力霉素，設(shè)為非整倍體組，并設(shè)立不加鹽酸強(qiáng)力霉素的HCT116細(xì)胞作為對(duì)照組，稱為整倍體組，撤藥當(dāng)天為第1天，在撤藥后第11天，采用0、100、250 μmol/L的AZT處理兩組細(xì)胞72 h，設(shè)立空白對(duì)照組和AZT處理組。

1. 檢測(cè)指標(biāo)： 在鹽酸強(qiáng)力霉素撤掉后第6、8、11天檢測(cè)整倍體組和非整倍體組細(xì)胞hTERT基因及端粒酶活性。在撤藥后第11天對(duì)整倍體組和非整倍體組細(xì)胞進(jìn)行染色體滴定，取撤藥后第3天、第6天、第11天的細(xì)胞，檢測(cè)MAD2L1蛋白表達(dá)，檢測(cè)AZT處理組hTERT mRNA基因及端粒酶活性表達(dá)。

2. hTERT mRNA基因表達(dá)： 在撤藥后第6、8、11天采用RT-PCR檢測(cè)整倍體組和非整倍體細(xì)胞中hTERT mRNA基因表達(dá)差異，RT-PCR檢測(cè)空白對(duì)照組及其AZT處理組hTERT mRNA基因的表達(dá)hTERT正向引物：5′-AAGTTCCTGCACTGGCTGATG-3′，反向引物：5′-GCTTTGCAACTTGCTCCAGAC-3′。使用GAPDH作為內(nèi)參。按照RNA提取步驟提取總RNA，采用酶標(biāo)儀進(jìn)行定量，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用thermo逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，逆轉(zhuǎn)錄完畢后，采用vazyme公司的SYBR Green熒光定量試劑，進(jìn)行熒光定量擴(kuò)增。設(shè)置反應(yīng)體系為95.0 ℃ 5 min，95.0 ℃ 10 s和60 ℃ 30 s共40個(gè)循環(huán)，95.0 ℃ 15 s， 60 ℃ 1 min，95.0 ℃ 15 s終止反應(yīng)。

3. 端粒酶活性檢測(cè)： 在撤藥后第6、8、11天采用端粒酶活性試劑盒(TRAP-PCR-ELISA)對(duì)整倍體組和非整倍體組細(xì)胞端粒酶活性進(jìn)行檢測(cè)，采用0、100、250 μmol/L的AZT處理兩組細(xì)胞72 h后，采用TRAP-PCR-ELISA檢測(cè)端粒酶活性的變化。收集待測(cè)細(xì)胞(2.5×103個(gè))，制備端粒酶提取液，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR條件：引物延伸 25 ℃ 15 min，端粒酶滅活 94 ℃ 5 min，擴(kuò)增共30個(gè)循環(huán)：變性 94 ℃ 30 s，退火 50 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 90 s。72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存 PCR 產(chǎn)物。取擴(kuò)增產(chǎn)物2.5 μl，進(jìn)行ELISA反應(yīng)。從酶標(biāo)儀上讀取其在 450 nm 處的 OD 值，以690 nm處作為參考波長(zhǎng)。端粒酶活性(RTA)計(jì)算公式為RTA=(AS-ASO)/AS.IS/[(ATS8-ATS8.0)/ATS8.IS]×100%，ΔA=AS-ASO，若ΔA大于兩倍的ASO則判定為端粒酶陽(yáng)性；AS：樣品吸光度；ASO：熱處理后樣品吸光度；AS.IS︰IS樣品吸光度；ATS8：對(duì)照模板吸光度；ATS8.0：裂解液吸光度；ATS8.IS：對(duì)照模板的IS吸光度；由試劑盒提供陽(yáng)性對(duì)照(為含有端粒重復(fù)序列的DNA片段)，陰性對(duì)照為將端粒酶提取物在85 ℃環(huán)境中處理10 min。

4. 染色體滴定： 取撤藥后生長(zhǎng)至第11天的整倍體組和非整倍體組細(xì)胞加入80 ng/ml的有絲分裂抑制劑nocodazole和10 μmol/L的蛋白酶抑制劑MG132，在37 ℃孵箱中孵育6 h后，按照染色體滴定的步驟進(jìn)行處理，然后滴于玻片上，待玻片晾干后使用吉姆薩染液進(jìn)行染色，待晾干后采用Eukitt? 快速硬化封片劑進(jìn)行封片，封片后在100×的油鏡下進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)，選取150個(gè)細(xì)胞進(jìn)行拍照并對(duì)其染色體數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)。將染色體數(shù)目為45條或46條定義為整倍體(根據(jù)ATCC細(xì)胞庫(kù)中關(guān)于HCT116細(xì)胞染色體核型的描述)，將染色體數(shù)目不是45或46條的細(xì)胞定義為非整倍體。

5. MAD2L1蛋白表達(dá)測(cè)定： Western blot 檢測(cè)兩組細(xì)胞撤藥后第3天、第6天、第11天MAD2L1蛋白表達(dá)變化。在撤藥后第3天、第6天、第11天分別收集整倍體組和非整倍體細(xì)胞，采用裂解液裂解細(xì)胞后獲得總蛋白。采用bio-rad法于575 nm處測(cè)定總蛋白濃度。然后，配制12%的SDS-PAGE分離蛋白樣品，上樣量60 μg，采用PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，恒壓2 h，5%的脫脂奶粉封閉1.5 h，一抗MAD2L1(1︰200稀釋)4 ℃封閉過夜。TBST洗滌3次后，室溫孵育二抗(1︰2 000稀釋)1 h，采用ECL化學(xué)發(fā)光劑進(jìn)行顯色，采用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影并拍照。目的蛋白的灰度值與內(nèi)參α-Tublin灰度值的比值代表樣品中目的蛋白的相對(duì)含量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，兩獨(dú)立樣本率比較采用χ2檢驗(yàn)，組內(nèi)比較及組間比較采用雙因素方差分析，P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié) 果

一、染色體滴定

整倍體組中的150個(gè)細(xì)胞中，有10個(gè)是非整倍體，其整倍體率為93.3%，在非整倍體組的150個(gè)細(xì)胞中，共有117個(gè)細(xì)胞為非整倍體，非整倍體率為78%，見表1。

表1 整倍體組和非整倍體組細(xì)胞第11天染色體滴定結(jié)果比較

二、MAD2L1蛋白表達(dá)

在加入鹽酸強(qiáng)力霉素第3天后非整倍體組MAD2L1蛋白表達(dá)明顯下降，兩組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。第6天時(shí)，MAD2L1逐漸恢復(fù)，第11天時(shí)，MAD2L1完全恢復(fù)正常，見圖1。

三、 撤藥后第6、8、11天hTERT mRNA基因表達(dá)及端粒酶活性

整倍體組和非整倍體組細(xì)胞在第6、8、11天hTERT mRNA基因的表達(dá)量分別為(1︰1.19±0.05、1︰1.21±0.02、1︰1.46±0.04)。非整倍體hTERT mRNA基因表達(dá)明顯高于整倍體，兩組細(xì)胞在第6、8、11天比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。整倍體組和非整倍體組細(xì)胞在第6、8、11天端粒酶活性分別為(2.87±0.01︰3.14±0.10、2.89±0.01︰3.25±0.03、2.79±0.03︰4.26±0.15)，非整倍體組細(xì)胞的端粒酶活性明顯高于整倍體，兩組細(xì)胞在第6、8、11天比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見圖2。

圖1 加入鹽酸強(qiáng)力霉素后不同時(shí)間MAD2L1蛋白的表達(dá)變化

圖2 hTERT基因表達(dá)及端粒酶活性；注：A：整倍體組和非整倍體組細(xì)胞hTERT基因表達(dá)；B：整倍體組和非整倍體組細(xì)胞第11天端粒酶活性比較

四、AZT處理后hTERT mRNA基因表達(dá)及端粒酶活性

采用100、250 μmol/L的AZT作用整倍體和非整倍體細(xì)胞后，兩組細(xì)胞hTERT mRNA基因表達(dá)及端粒酶活性均出現(xiàn)不同程度的下降。與空白對(duì)照組相比，整倍體組hTERT mRNA基因表達(dá)在250 μmol/L處具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；端粒酶活性表達(dá)在100、250 μmol/L處具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。與空白對(duì)照組相比，非整倍體組hTERT mRNA基因表達(dá)及端粒酶活性在100、250 μmol/L處均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。非整倍體組hTERT mRNA基因及端粒酶活性下降程度較整倍體組更明顯，整倍體組細(xì)胞在100、250 μmol/L處的hTERT mRNA基因下降率分別為5%、32%，端粒酶活性下降率為14.69%、25.40%；非整倍體組細(xì)胞在100、250 μmol/L處的hTERT mRNA基因下降率分別為38.46%、51.28%，端粒酶活性下降率為17.00%、54.27%，兩組細(xì)胞hTERT mRNA基因下降率在100、250 μmol/L處具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。兩組細(xì)胞端粒酶活性下降率在250 μmol/L處具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見圖3。

圖3 hTERT基因表達(dá)及端粒酶活性；注：A：不同濃度AZT作用后hTERT基因表達(dá)情況；B：不同濃度AZT作用下端粒酶活性表達(dá)情況

討 論

非整倍體與腫瘤形成之間的關(guān)系一直以來備受關(guān)注，一些研究者認(rèn)為非整倍體只是腫瘤形成過程中的一個(gè)產(chǎn)物，另外一些研究者認(rèn)為非整倍體可以促進(jìn)腫瘤形成。Duesberg等[6]提出的非整倍體假說認(rèn)為，非整倍體可以促進(jìn)腫瘤形成，他認(rèn)為致癌物使細(xì)胞形成非整倍染色體，非整倍體導(dǎo)致有絲分裂相關(guān)基因異常表達(dá)，產(chǎn)生異常數(shù)目的中心粒及異常比例的紡錘體。不均衡的紡錘體可引起有絲分裂過程中染色體的隨機(jī)獲得或丟失，非整倍染色體隨機(jī)分配到子代細(xì)胞中，經(jīng)過不斷的惡性循環(huán)，非整倍體催化自身細(xì)胞核型的不斷變化及進(jìn)化，最終產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞核型。大量研究發(fā)現(xiàn)非整倍體可以促進(jìn)腫瘤形成，具有3條8號(hào)染色體會(huì)促進(jìn)血液方面的腫瘤發(fā)生，25%的慢性粒細(xì)胞白血病及10%～15%的急性粒細(xì)胞白血病以及5%的急性淋巴細(xì)胞白血病患者都會(huì)出現(xiàn)3條8號(hào)染色體[7-9]。

研究表明一系列細(xì)胞壓力因子可以導(dǎo)致非整倍體的形成[10-11]，Meena等[3]通過采用慢病毒敲除GJB3、RXFP1(LGR7)、OSBPL、STARD9等基因獲得非整倍體，這些基因與腫瘤形成及整倍體形成的相關(guān)通路有關(guān)[12-16]。Li等[17]通過運(yùn)用siRNA敲低MAD2L1獲得非整倍體，MAD2L1(MAD2)是紡錘體組裝檢查位點(diǎn)(SAC)的成分，SAC具有促使減數(shù)分裂過程中同源染色體或有絲分裂中姐妹染色單體間張力的形成[18]。如果SAC在有絲分裂過程中出現(xiàn)異常，則會(huì)導(dǎo)致染色體的錯(cuò)誤分離，形成非整倍體。既往研究中尚未有人采用鹽酸強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)非整倍體，據(jù)相關(guān)報(bào)道表明，鹽酸強(qiáng)力霉素可能具有誘導(dǎo)非整倍體的作用，本研究就這一問題進(jìn)行嘗試，證實(shí)鹽酸強(qiáng)力霉素可以誘導(dǎo)非整倍體。我們就鹽酸強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)非整倍體的機(jī)制進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在撤藥后第3天，非整倍體細(xì)胞MAD2L1表達(dá)完全消失，表明鹽酸強(qiáng)力霉素能夠破壞SAC的成分MAD2L1，導(dǎo)致染色體的錯(cuò)誤分離，繼而形成非整倍體，而隨著撤藥時(shí)間的增加，細(xì)胞MAD2L1逐漸恢復(fù)正常，表明不健康的非整倍體細(xì)胞大量死亡，而存活下來的非整倍體則可以繼續(xù)生長(zhǎng)及增殖。與既往通過shRNA敲除相關(guān)基因或采用siRNA敲低MAD2等方法相比，采用藥物誘導(dǎo)非整倍體的方法操作簡(jiǎn)便，價(jià)格便宜，為之后非整倍體的獲得提供了一個(gè)簡(jiǎn)單易行的方法。

端粒酶由hTERT、端粒酶RNA組分、端粒酶相關(guān)蛋白組成，是一種核糖蛋白復(fù)合物，能以自身RNA為模板，合成端粒重復(fù)序列，將端粒DNA送至真核細(xì)胞染色體末端，使端粒延長(zhǎng)。hTERT在端粒酶的激活過程中起關(guān)鍵作用，端粒酶活性的表達(dá)與其密切相關(guān)[19]。研究表明，部分腫瘤細(xì)胞由于端粒酶的作用，能無限增殖，從而成為永生化細(xì)胞。Zhang等[20]通過在羊胚胎成纖維細(xì)胞中導(dǎo)入hTERT基因，可以使羊胚胎成纖維細(xì)胞獲得無限增殖，從而成為永生化細(xì)胞。Meena等[3]研究發(fā)現(xiàn)，端粒酶可以拯救非整倍體誘導(dǎo)的端粒DNA的損傷、p53的激活、細(xì)胞早衰和耗竭。而關(guān)于整倍體與非整倍體之間端粒酶活性及hTERT基因表達(dá)的差異及作用，尚未有人進(jìn)行相關(guān)研究，本研究發(fā)現(xiàn)非整倍體的端粒酶活性及hTERT基因表達(dá)明顯高于整倍體。本研究分別在第6、8、11天檢測(cè)hTERT基因及端粒酶活性，發(fā)現(xiàn)非整倍體hTERT基因及端粒酶活性表達(dá)逐漸升高，表明非整倍體的形成是一個(gè)不斷變化及進(jìn)化的過程，在撤藥初期，不健康的非整倍體大量死亡，一部分非整倍體逃脫P(yáng)53介導(dǎo)的凋亡作用，催化自身功能的不斷進(jìn)化，某些細(xì)胞產(chǎn)生促進(jìn)腫瘤形成的核型，從而發(fā)揮促腫瘤形成作用。

AZT是應(yīng)用最廣的一種端粒酶抑制劑，能阻斷端粒復(fù)制模板與單核苷酸之間的結(jié)合，使腫瘤細(xì)胞維持端粒長(zhǎng)度的機(jī)制遭到破壞，從而導(dǎo)致端粒隨著自身染色體復(fù)制而逐漸縮短，最終促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生衰老凋亡[21-26]。研究表明，AZT可以對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的端粒酶活性產(chǎn)生抑制作用，干擾細(xì)胞的正常生長(zhǎng)及增殖[27-30]。本研究?jī)山M細(xì)胞加入AZT后，hTERT基因表達(dá)及端粒酶活性均出現(xiàn)不同程度下降，表明AZT可以下調(diào)hTERT基因表達(dá)及端粒酶活性，非整倍體組細(xì)胞下降程度較整倍體明顯，表明非整倍體對(duì)AZT更敏感。

綜上所述，鹽酸強(qiáng)力霉素可以通過破壞紡錘體組裝檢查位點(diǎn)(SAC)的成分MAD2L1來誘導(dǎo)非整倍體形成，非整倍體細(xì)胞的端粒酶活性及hTERT基因表達(dá)高于整倍體，加入AZT后，整倍體細(xì)胞和非整倍體細(xì)胞hTERT基因表達(dá)及端粒酶活性均出現(xiàn)不同程度下降，非整倍體下降程度較整倍體明顯，非整倍體對(duì)AZT更敏感。而關(guān)于AZT對(duì)整倍體及非整倍體細(xì)胞功能的影響及其機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

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