王林玉，施文韜，黃夢楠，師娟子

(1.西北婦女兒童醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，陜西 西安 710061；2.寧夏藥品檢驗(yàn)研究院，寧夏 銀川 750004；3.億康基因，上海 201499；4.西北婦女兒童醫(yī)院輔助生殖中心，陜西 西安 710003)

染色體非整倍體是指染色體數(shù)目異常。染色體非整倍體是導(dǎo)致胎兒嚴(yán)重智力低下及先天畸形的主要原因之一，在活產(chǎn)新生兒中的發(fā)生率約為0.5%[1-2]。目前，尚無有效的治療方法，一旦患兒出生將給家庭和社會帶來沉重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。植入前遺傳學(xué)篩查(preimplantation genetic screening，PGS)，是在胚胎植入著床之前對早期胚胎進(jìn)行染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常的檢測，挑選正常的胚胎植入子宮，以期獲得正常的妊娠，提高患者的臨床妊娠率，降低流產(chǎn)率，預(yù)防出生缺陷。同時，由于多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)—二代測序技術(shù)(MALBAC-NGS)的出現(xiàn)，推動染色體異常的診斷技術(shù)不斷向更精確、更快速的方向發(fā)展[3-5]。近年來，有文章報道了雙親染色體異常、反復(fù)種植失敗和復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RSA)患者與胚胎非整倍體發(fā)生率有關(guān)，對此類患者實(shí)施PGS均能達(dá)到滿意的治療效果，減少了流產(chǎn)率，減少了無效移植次數(shù)，提高了妊娠率[6]?；诖?，本文就易位、羅氏易位、倒位、非整倍體、Y染色體微缺失、衍生染色體、不良孕產(chǎn)史等其他PGS指征與胚胎非整倍體的關(guān)系作初步研究，以期找到更多可以預(yù)測非整倍體的指標(biāo)來輔助臨床工作，并提供正確的臨床咨詢，以使更多患者可以從PGS技術(shù)最大獲益。

1資料與方法

1.1研究對象與分組

2018年6月1日至2018年11月30日收集西北婦女兒童醫(yī)院生殖中心288例行PGS患者的胚胎，胚胎培養(yǎng)至囊胚期進(jìn)行活檢，PGS檢測采用MALBAC-NGS方法，比較不同年齡段和不同PGS指征胚胎染色體異常率。PGS檢測在西北婦女兒童醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心完成，所有進(jìn)入臨床PGS周期的患者均簽署知情同意書。最終有效檢出結(jié)果的胚胎數(shù)為275枚，以女性年齡為分組依據(jù)，分為≤27歲(79例)、28～30歲(82例)、31～33歲(62例)、34～36歲(31例)、≥37歲(21例)共5組。

1.2方法

1.2.1囊胚活檢

當(dāng)囊胚達(dá)到活檢標(biāo)準(zhǔn)時，在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)對側(cè)用非接觸式激光儀在透明帶上打孔。完畢后繼續(xù)將囊胚培養(yǎng)4～6h，使部分滋養(yǎng)層形成疝。活檢時，使內(nèi)細(xì)胞團(tuán)位于固定針一側(cè)，活檢針靠近形成疝的外滋養(yǎng)層細(xì)胞緩慢回吸，發(fā)射激光，直至活檢的外滋養(yǎng)層細(xì)胞(10個左右)全部脫離囊胚。活檢的細(xì)胞組織培養(yǎng)液洗滌后放入裝有5μL細(xì)胞裂解液的PCR管內(nèi)，離心后在-40℃凍存待檢?；顧z后囊胚冷凍保存。

1.2.2 PGS檢測

采用MALBAC方法將待測樣本進(jìn)行單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增，向待測樣本和對照品的PCR管中分別加入裂解酶，放入設(shè)定好參數(shù)的PCR儀中，裂解細(xì)胞，隨后經(jīng)過預(yù)擴(kuò)增將微量初始模板進(jìn)行線性擴(kuò)增，最后經(jīng)過指數(shù)擴(kuò)增即完成文庫構(gòu)建。將構(gòu)建好的文庫純化后定量，隨后測序文庫與引物、dNTPs、DNA聚合酶、引物載體構(gòu)建“油包水”PCR反應(yīng)單元后在DA8600測序平臺完成NGS測序工作。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 23.0進(jìn)行。計(jì)數(shù)資料采用率(%)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述，組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)，不滿足χ2檢驗(yàn)條件，則采用Fisher確切概率法檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α設(shè)定為0.05。

2結(jié)果

2.1基本數(shù)據(jù)

PGS共活檢288枚胚胎，其中13枚胚胎因質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)不合格未檢出結(jié)果，因此有效檢出結(jié)果的胚胎數(shù)為275枚。在這275枚胚胎中，整倍體胚胎數(shù)目為141(51.27%)，非整倍體胚胎數(shù)目為134(48.73%)。在染色體異常的胚胎中以異常染色體數(shù)目為1條[57/134(42.54%)]和2條[50/134(37.31%)]最為常見，見圖1。若夫妻雙方中僅女方染色體異常，則其產(chǎn)生非整倍體胚胎數(shù)目為43(59.72%)，若夫妻雙方中僅男方染色體異常，則其產(chǎn)生非整倍體胚胎數(shù)目為59(49.17%)，見表1。

圖1 異常染色體數(shù)目的發(fā)生頻率Fig.1 The frequency of abnormal chromosome numbers

表1 不同性別的染色體異?；颊吲咛フ扼w率和非整倍體率的比較 [n(%)]Table 1 Comparison of the rate of euploid and aneuploidy in patients with chromosomal abnormalities of different genders [n(%)]

2.2不同年齡段女性胚胎整倍體率和非整倍體率的比較

以女性年齡為分組依據(jù)，分為≤27歲、28～30歲、31～33歲、34～36歲、≥37歲共5組?？傮w上看，隨著女方年齡的增加，胚胎非整倍體率也隨之增加。然而，不同年齡女性患者的胚胎整倍體率與非整倍體率比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見表2。

表2 不同年齡段女性胚胎整倍體率和非整倍體率的比較 [n(%)]Table 2 Comparison of the rate of euploid and aneuploidy in different age groups of female [n(%)]

2.3不同PGS指征胚胎整倍體率和非整倍體率的比較

不同PGS指征中，以相互易位(36.84%)和RSA(18.60%)最為常見。PGS指征為染色體相互易位共有105例，其中非整倍體胚胎數(shù)目為71個(非整倍體率67.62%)；PGS指征為染色體倒位共有3例，其中非整倍體胚胎數(shù)目為2個(非整倍體率66.67%)；PGS指征為衍生染色體共有9例，其中非整倍體胚胎數(shù)目為7個(非整倍體率77.78%)；PGS指征為不良孕產(chǎn)史、反復(fù)種植失敗、RSA分別有28例、9例、53例，其中非整倍體胚胎數(shù)目分別為11個(非整倍體率39.29%)、2個(非整倍體率22.22%)、24個(非整倍體率45.28%)。總體上看，平衡易位、倒位、衍生染色體等雙親染色體異?？赡芨讓?dǎo)致胚胎非整倍體的發(fā)生，見表3。

2.4不同PGS指征單個胚胎各染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常的發(fā)生頻率

胚胎染色體異常中11、13、14、22號染色體及性染色體異常發(fā)生率較高(分別占9.19%、10.95%、6.71%、6.01%、8.83%)。發(fā)生染色體相互易位的患者胚胎的11、13、14、22、5號染色體異常率較高(分別占9.52%、16.67%、7.14%、6.55%、6.55%)；染色體非整倍體患者胚胎的14、2號染色體異常率較高(分別占19.05%、14.29%)；不良孕產(chǎn)史患者胚胎的8、21號染色體異常率較高(分別占17.65%、17.65%)；RSA患者胚胎的7、11、16號染色體及性染色體異常率較高(分別占7.90%、13.16%、7.90%、15.79%)，見表4。

表3 不同PGS指征胚胎整倍體率和非整倍體率的比較 [n(%)]Table 3 Comparison of the rate of euploid and aneuploidy with different PGS indications [n(%)]

表4 不同PGS指征單個胚胎各染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常的發(fā)生情況 (n)Table 4 Frequency of chromosome numbers or structure abnormal with different PGS indications (n)

3討論

3.1胚胎的非整倍體

非整倍體是最常見的染色體數(shù)目異常,發(fā)生于卵母細(xì)胞或胚胎，可導(dǎo)致胚胎種植失敗、自發(fā)性流產(chǎn)和新生兒出生缺陷。據(jù)歐洲人類生殖與胚胎學(xué)會(ESHRE)10年P(guān)GS數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，共活檢89 373枚胚胎，僅有33%的胚胎染色體正常，適合移植[7]。有研究報道早期自然流產(chǎn)是健康育齡婦女常見的妊娠并發(fā)癥，占臨床妊娠的10%～15%，其病因眾多，以遺傳因素(尤其是胎兒染色體數(shù)目異常)最多見，孕婦年齡是迄今唯一被證實(shí)的與胚胎非整倍體的發(fā)生密切相關(guān)的流行病學(xué)因素。此外，研究表明反復(fù)種植失敗患者可通過PGS獲得臨床妊娠[8-9]。大約50%的RSA患者沒有明確的原因，對流產(chǎn)物的妊娠分析表明染色體非整倍性率很高[10-11]。在向此類夫婦普遍推薦這種治療之前，需要進(jìn)行研究以確定哪些患者最有可能從PGS中受益。然而相關(guān)的研究很少。因此本文就不同PGS指征的患者與胚胎非整倍體之間的關(guān)系作橫向比較，以期為臨床工作提供一些幫助。

3.2女性年齡與胚胎非整倍體的相關(guān)性

本文共檢測288枚胚胎，有效檢出結(jié)果的胚胎數(shù)為275枚，其中整倍體胚胎數(shù)目為141(51.27%)，非整倍體胚胎數(shù)目為134(48.73%)。在染色體異常的胚胎中以異常染色體數(shù)目為1條(42.54%)和2條(37.31%)最為常見。女方染色體異常者胚胎非整倍體率較高(59.72%)，這提示我們，女方染色體異?？赡芨滓鹋咛ト旧w異常。

以女方年齡分組后，總體上看，隨著年齡的增加，胚胎非整倍體率也隨之增加。34～36歲及≥37歲組的樣本數(shù)相對較少(分別為31、21例)，這可能也是造成其非整倍體率較低的原因。

3.3不同PGS指征與胚胎非整倍體的相關(guān)性

在不同PGS指征中，以相互易位和RSA最為常見。不良孕產(chǎn)史、反復(fù)種植失敗、RSA患者產(chǎn)生的非整倍體胚胎數(shù)目分別為11個(45.16%)、2個(22.22%)、24個(45.28%)；平衡易位、羅氏易位、倒位、非整倍體及衍生染色體患者產(chǎn)生的非整倍體胚胎數(shù)分別為71個(67.72%)、8個(40.00%)、2個(66.67%)、11個(42.31%)和7個(77.78%)。雙親染色體異?？赡芨讓?dǎo)致胚胎染色體異常，不良孕產(chǎn)史、RSA、Y染色體微缺失患者的胚胎非整倍體率也近乎50.00%。這提示我們在臨床上遇到此類患者要盡可能推薦其做PGS，篩選出正常的胚胎，進(jìn)而獲得較好的妊娠結(jié)局。

同時，由于現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，運(yùn)用于PGS的遺傳學(xué)分析技術(shù)也在不斷更新。本文所采用的MALBAC-NGS技術(shù)，對單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增采用的是多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(multiple annealing and looping-based amplification cycles,MALBAC)這一全新的全基因組擴(kuò)增(whole genome amplification,WGA)方法，采用特殊設(shè)計(jì)的引物，對整個基因組實(shí)現(xiàn)高效而又均衡的全擴(kuò)增[12-13]。且其作為一項(xiàng)高通量、高度自動化的可用于染色體非整倍體篩查的技術(shù)，在精確度、靈敏度、特異性、分辨率等方面都有表現(xiàn)不凡的優(yōu)勢。