， ，

(東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

桃葉衛(wèi)矛(EuonymusbungeanusMaxim)，又名絲棉木、白杜、明開夜合，是衛(wèi)矛科衛(wèi)矛屬一種暖溫帶樹種，廣泛分布于我國境內(nèi)，除廣東、廣西兩地未見野生種外，北起黑龍江，內(nèi)蒙古等地，南至長江兩岸各省區(qū)均有野生資源存在，同時在世界上的其他一些國家也有分布，如烏蘇里地區(qū)、西伯利亞南部和朝鮮半島等地[1]。桃葉衛(wèi)矛樹皮灰色，幼時光滑，老時淺縱裂，樹冠圓形或卵圓形。花期5—6月，花色淡綠，聚傘花序。果期9—10月，蒴果粉紅色，可長期宿存于枝上。在冬季與白雪相互掩映，具有較高的觀賞價值[2]。桃葉衛(wèi)矛材質(zhì)堅韌細(xì)致而潔白，可作雕刻用材，工藝制品等。劉繼陽等研究發(fā)現(xiàn)，桃葉衛(wèi)矛果實(shí)總皂苷對人肝癌細(xì)胞系-SMMC、人宮頸癌細(xì)胞系-HeLa和乳腺癌細(xì)胞系-MCF 7有明顯的抑制生長作用[3]。孫榮花等通過對桃葉衛(wèi)矛葉片提取物對CCL4致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，桃葉衛(wèi)矛葉EtOAc和n-BuOH提取物具有良好的抗氧化效果和保肝作用，說明桃葉衛(wèi)矛葉作為茶飲用的同時具有保健作用[4]。由此表明，桃葉衛(wèi)矛具有極高的藥用價值，有待進(jìn)一步的開發(fā)利用。

種子的休眠現(xiàn)象在植物種子中廣泛存在，了解并掌握種子的休眠機(jī)理，對于解除其休眠具有重要的指導(dǎo)意義[5-8]。由于桃葉衛(wèi)矛在生產(chǎn)實(shí)踐中廣泛采用播種育苗的方式[9]，若種子存在休眠現(xiàn)象，可能會導(dǎo)致出苗時間參差不齊，出苗率低。而現(xiàn)有的報道主要集中于桃葉衛(wèi)矛的種子催芽、栽培技術(shù)等方面。雖然對其種子催芽的方法已有探討，但對于其種子的休眠機(jī)理還沒有過系統(tǒng)的研究[10-12]。Baskin C C等[13]提出了一個全面的種子休眠分類系統(tǒng)，其中包括 5 個分類：生理休眠(PD)、形態(tài)休眠(MD)、形態(tài)生理休眠(MPD)、物理休眠(PY)、混合型休眠(PY+PD)。根據(jù)以上5種休眠的形成機(jī)制，采用室內(nèi)試驗測試和統(tǒng)計分析方法，通過研究桃葉衛(wèi)矛種子種皮特性、胚形態(tài)發(fā)育及種子內(nèi)源抑制物質(zhì)，來探討桃葉衛(wèi)矛種子的休眠機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

桃葉衛(wèi)矛種子來源于黑龍江省哈爾濱市東北林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)，選取 4株生長良好的桃葉衛(wèi)矛母樹采集種子。于2015年10月進(jìn)行采種，測定種子千粒重為15.935 g，含水量6.0%。

1.2 研究方法

1.2.1 種子生活力與發(fā)芽能力測定

生活力測定：按《林木種子檢驗規(guī)程》[14]規(guī)定的TTC法進(jìn)行測定。

發(fā)芽能力測定：種子發(fā)芽能力用發(fā)芽率表示。種子發(fā)芽試驗參照《國際種子檢驗規(guī)程》的方法[15]。

1.2.2 種皮透水性測定

取桃葉衛(wèi)矛種子6份，每份取1 g，其中3份用解剖針撬開外種皮，另3份為對照。每份種子稱質(zhì)量后置25 mL試管中，加入一定量的蒸餾水，置恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃吸脹。每隔2 h取出種子，用濾紙吸干種子表面浮水，稱質(zhì)量，然后放回試管中繼續(xù)吸水，直至種子吸水至恒定質(zhì)量[16]。

1.2.3 種胚后熟過程中的形態(tài)發(fā)育

分別采用低溫沙藏和變溫沙藏的方法對種子進(jìn)行處理，沙藏時間分別為7，14，21，28 d，然后進(jìn)行取樣，每次10粒，以沙藏前的種子為對照，并解剖觀察種胚的形態(tài)和大小。具體操作為:沿種子的中軸線進(jìn)行縱切，使胚和胚乳露出，在體視顯微鏡下觀察并測量種胚及胚乳的長度，計算胚率[17]。

1.2.4 種子內(nèi)源抑制物質(zhì)的生物測定

稱取2 g種子、胚乳和胚，分別置于錐形瓶中然后加入50 mL二氯甲烷溶液并混勻，然后密閉放入4 ℃冰箱中，每12 h震蕩1次，于36 h后過濾浸提液。將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠，RE-52)于40 ℃下蒸干，然后用蒸餾水定容至 50 mL[18]。最后，將浸提液分別稀釋至25%、50%、75%。

采用三葉草種子進(jìn)行內(nèi)源抑制物生物活性測定。每個培養(yǎng)皿中置50粒三葉草種子，分別取上述各體積分?jǐn)?shù)的浸提液，每個培養(yǎng)皿注入5 mL。以同體積的蒸餾水作為對照。每處理3次重復(fù)，在恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)25 ℃進(jìn)行培養(yǎng)，48 h后統(tǒng)計三葉草種子的發(fā)芽粒數(shù)(以露出子葉為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn))，72 h后測定苗高和根長。

1.2.5 種子催芽(休眠解除)方法

針對桃葉衛(wèi)矛種子可能的休眠機(jī)制，采用赤霉素結(jié)合層積處理的方法和二因素完全隨機(jī)的方法，共設(shè)計了25種不同的催芽方法來探索適宜的催芽方法。

表1 因素水平

赤霉素處理: 將桃葉衛(wèi)矛種子進(jìn)行消毒處理后，在室溫下用不同濃度赤霉素溶液浸種催芽48 h，赤霉素濃度分別為100，200，300，400 mg/L；層積溫度：1) 25 ℃層積：將經(jīng)過5 g/kg KMnO4溶液消毒的種子與濕沙( 沙∶種=3∶1) 混勻后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中層積28 d；2) 4 ℃層積:將消毒后的種子與濕沙混勻后，在4 ℃下低溫層積28 d；3) 25 ℃/4 ℃層積:將消毒后的種子與濕沙混勻后，先在25 ℃下暖溫層積14 d，再轉(zhuǎn)移至4 ℃下低溫層積14 d；4) 4 ℃/25 ℃層積: 將消毒后的種子與濕沙混勻后，先在4 ℃下低溫層積14 d，再轉(zhuǎn)移至25 ℃下暖溫層積14 d。層積過程中每3 d適當(dāng)補(bǔ)水，保持良好的水分和通氣狀態(tài)。

將上述處理后的桃葉衛(wèi)矛種子進(jìn)行萌發(fā)試驗。具體方法參照1.2.1中發(fā)芽率測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用Excel及SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析、方差分析及差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 新采收桃葉衛(wèi)矛種子生活力與發(fā)芽力

種子生活力是指發(fā)芽的潛力或種胚所具有的生命力[19]。種子發(fā)芽力是指種子在適宜條件下能發(fā)芽并能長成植株的能力，是判斷種子播種品質(zhì)最重要的指標(biāo)，用發(fā)芽勢和發(fā)芽率來表示。而判斷該種子是否存在休眠，則可以通過比較種子生活力和種子發(fā)芽力，若種子生活力高于發(fā)芽力，說明該種子存在休眠。試驗結(jié)果表明，供試的桃葉衛(wèi)矛種子生活力為93%，而其發(fā)芽勢為0，發(fā)芽率為11%，種子生活力遠(yuǎn)大于其發(fā)芽率，表明桃葉衛(wèi)矛種子可能存在顯著休眠，還需要進(jìn)一步探究。

2.2 桃葉衛(wèi)矛種子透水性測定

由圖1可以看出，0～4 h內(nèi)破皮種子的吸水速率和吸水率急劇上升，4～24 h內(nèi)破皮種子的吸水速率逐漸降低，而吸水率趨于平穩(wěn)，24 h以后破皮種子的吸水率達(dá)到飽和，含水率為61.8%；而完整種子在0～12 h內(nèi)吸水速率基本保持恒定，吸水率逐步升高，24 h后完整種子的吸水率達(dá)到61.1%，與破皮種子基本保持一致。

圖1 桃葉衛(wèi)矛種子吸水進(jìn)程曲線

2.3 桃葉衛(wèi)矛種子催芽過程中胚形態(tài)發(fā)育

不同層積溫度及層積時間對桃葉衛(wèi)矛種子胚率的影響如圖2所示。由圖2可知，層積前桃葉衛(wèi)矛種子胚率為25.57%，當(dāng)層積溫度為4 ℃、4 ℃/25 ℃時，通過28 d的觀察比較后可知，桃葉衛(wèi)矛種子胚率與層積前基本保持一致，差異不顯著；當(dāng)層積溫度為25 ℃時，層積14 d后的種子胚率與層積前相比降低了3.17%，差異顯著，其余觀察時間的胚率與層積前差異不顯著；當(dāng)層積溫度為25 ℃/4 ℃時，層積21 d后的種子胚率比層積前下降了3.73%，差異顯著，其余觀察時間胚率大小與層積前相比無明顯變化。

2.4 桃葉衛(wèi)矛種子內(nèi)源抑制物活性測定

不同部位的浸提液對三葉草種子發(fā)芽率和幼苗生長的影響如表2所示。當(dāng)浸提液提取部位為胚時，不同濃度的浸提液對三葉草種子發(fā)芽率沒有顯著的抑制作用(p>0.05)，由表2可以看出，經(jīng)不同濃度浸提液處理后，三葉草幼苗的苗高與對照組差異不顯著，僅濃度為50%的胚浸提液處理后三葉草幼苗根長與對照組差異性顯著(p<0.05)；當(dāng)浸提部位為胚乳時，不同濃度的浸提液對三葉草種子發(fā)芽率的影響十分顯著(p<0.05)，由表2可以看出，隨著胚乳浸提液濃度的提高，三葉草種子發(fā)芽率較對照組分別降低了24%、38.34%、80.34%，同時胚乳浸提液對三葉草幼苗的苗高和根長均有顯著影響(p<0.05)，當(dāng)胚乳浸提液濃度為50%時，三葉草幼苗苗高與其他濃度下的幼苗苗高差異性不顯著；當(dāng)浸提部位為種子時，不同濃度的浸提液對三葉草種子發(fā)芽率的影響十分顯著(p<0.05)，由表2可以看出，隨著種子浸提液濃度的提高，三葉草種子發(fā)芽率較對照組分別降低了31.34%、45%、55.34%，與之對應(yīng)的三葉草幼苗苗高和根長較對照也出現(xiàn)了顯著差異。

圖2 不同層積溫度及層積時間對桃葉衛(wèi)矛種子胚率的影響

表2 不同部位的浸提液對三葉草種子發(fā)芽率和幼苗生長的影響

注：數(shù)值代表實(shí)驗中每個處理3個重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，其后的小寫字母代表不同體積分?jǐn)?shù)浸提液與對照組的差異顯著性(p<0.05)。

2.5 種子休眠解除方法

不同濃度赤霉素和層積溫度對桃葉衛(wèi)矛種子發(fā)芽率影響的方差分析如表3所示。由表3可知，赤霉素和層積溫度對桃葉衛(wèi)矛種子發(fā)芽率的影響均達(dá)到了極顯著水平(p<0.01)，同時二者的交互效應(yīng)也達(dá)到了極顯著水平。從三者貢獻(xiàn)的離差平方和可以看出，赤霉素和層積溫度均為影響桃葉衛(wèi)矛種子發(fā)芽率的關(guān)鍵因素。由圖3可知，赤霉素處理和層積處理均會促進(jìn)桃葉衛(wèi)矛種子發(fā)芽，當(dāng)赤霉素濃度為0 mg/L時，不同的層積溫度均對桃葉衛(wèi)矛種子發(fā)芽率起到促進(jìn)作用，且不同層積溫度之間差異不顯著；當(dāng)赤霉素濃度達(dá)到100 mg/L或300 mg/L時， 25 ℃層積處理后的種子發(fā)芽率高于其他處理，且與對照組差異顯著；當(dāng)赤霉素濃度為200 mg/L時，25 ℃層積處理和4 ℃/25 ℃層積處理后種子發(fā)芽率高于其他處理；當(dāng)赤霉素濃度為400 mg/L時，未采用層積處理的種子出現(xiàn)嚴(yán)重霉變，其他層積處理之間差異不顯著。

表3 不同濃度赤霉素和層積溫度對桃葉衛(wèi)矛種子發(fā)芽率影響的方差分析

注：雙因素方差分析置信區(qū)間為95%。

圖3 不同濃度赤霉素處理和層積溫度對桃葉衛(wèi)矛種子發(fā)芽率的影響

3 討 論

種子休眠是影響種子萌發(fā)率的主要因素。本試驗中對新采收的桃葉衛(wèi)矛種子進(jìn)行TTC染色法檢測后，測定其生活力為93%，而標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗測定的發(fā)芽率僅為11%，由此可見，桃葉衛(wèi)矛種子存在一定程度的休眠。而引起種子休眠的原因有很多種，有的是屬于形態(tài)學(xué)上的特性，有的是屬于種子內(nèi)部的代謝特性；有的可能由一種因素造成，也可能由多種因素共同影響。其中造成種子休眠的主要原因有：種皮障礙、胚休眠、內(nèi)源抑制物的存在等[20]。因此本試驗通過對桃葉衛(wèi)矛種子種皮特性、胚形態(tài)發(fā)育及種子內(nèi)源抑制物質(zhì)的探究，進(jìn)一步探討造成其種子休眠的具體原因。

一般而言，植物種皮對種子造成的萌發(fā)障礙包括以下3點(diǎn)：種皮透水性差、種皮透氣性差以及種皮的機(jī)械障礙[5]。趙潔等對唐古特瑞香的種子進(jìn)行透水性檢驗后發(fā)現(xiàn)，唐古特瑞香種子吸水性良好[21]。對桃葉衛(wèi)矛種子的初步解剖和觀察結(jié)果表明，破皮種子的吸水速率雖然比完整種子的快，但是最終二者的吸水率是一致的，表明桃葉衛(wèi)矛種子種皮的透水性良好，不存在機(jī)械障礙導(dǎo)致其不能萌發(fā)。

以往的研究表明，種胚發(fā)育的適宜條件是在潮濕和一定溫度條件下，例如在濕土或濕沙中層積，經(jīng)數(shù)周或數(shù)月種胚就能發(fā)育完全并獲得發(fā)芽能力。因此本試驗中，將桃葉衛(wèi)矛種子混入濕沙中置于不同溫度條件下進(jìn)行層積。結(jié)果表明，不論采用何種層積方法桃葉衛(wèi)矛種子胚率在層積過程中都沒有出現(xiàn)顯著的變化，由此可以推斷桃葉衛(wèi)矛種子種胚已經(jīng)發(fā)育成熟。

種子中存在發(fā)芽抑制物抑制種子發(fā)芽，并且這種抑制物質(zhì)可以存在于種子的不同部位(種被、種胚或胚乳)中。因此，準(zhǔn)確判斷抑制物質(zhì)存在于種子的哪個部位可以有效地幫助種子快速催芽。本試驗對桃葉衛(wèi)矛種子不同部位進(jìn)行浸提而獲得抑制物質(zhì)，研究結(jié)果表明，桃葉衛(wèi)矛種子中的抑制物質(zhì)主要存在于胚乳中，而胚的浸提液抑制作用不明顯。

綜上所述，桃葉衛(wèi)矛種子種皮透水性良好，種胚發(fā)育成熟，導(dǎo)致其休眠的主要原因是種子中(主要是在胚乳中)存在發(fā)芽抑制物質(zhì)。因此，桃葉衛(wèi)矛屬于生理休眠(PD)[22]。同類型的休眠植物主要有：八棱海棠(Malusrobusta)[23]和山毛櫸(Fagussylvatica)[24]。而針對該類型的休眠，科研和生產(chǎn)上一般采用赤霉素結(jié)合層積的方法來進(jìn)行休眠解除。本試驗結(jié)果表明，桃葉衛(wèi)矛的最適催芽方法為300 mg/L赤霉素處理48 h后，再將種子置于25 ℃環(huán)境條件下層積28 d，種子發(fā)芽率可在10 d內(nèi)達(dá)到95%。

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