盧艷敏

(衡水學(xué)院生命科學(xué)系，河北衡水 053000)

抗菌肽是動(dòng)物天然免疫反應(yīng)的重要組成部分，具有廣譜抗菌活性，對(duì)細(xì)菌、真菌、原蟲和病毒均具有較強(qiáng)的殺傷作用[1]，另外還可以抗癌、促進(jìn)傷口愈合，因此具有較大的藥用開發(fā)價(jià)值?？咕氖巧矬w經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的具有抗菌活性的小分子多肽，在機(jī)體抵抗病原入侵中起著重要作用[2]，具有分子量小、抗菌譜廣、抗菌活性高、不易使病原菌產(chǎn)生耐藥性、不破壞動(dòng)物體細(xì)胞、無免疫原性等優(yōu)點(diǎn)?？咕淖饔脵C(jī)制獨(dú)特，主要有膜作用機(jī)制和胞內(nèi)作用機(jī)制。最新研究表明，抗菌肽還存在其他的殺菌機(jī)制，Chu等研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽α-defensin 6可以結(jié)合到鼠傷寒沙門氏菌表面，通過自我組裝，在細(xì)菌周圍形成一些小纖維和納米樣纖維，從而減少細(xì)菌黏附到腸道黏膜，以達(dá)到保護(hù)機(jī)體的目的[3]。汪以真發(fā)現(xiàn)，豬源hepcidin能夠使大腸桿菌K88聚集成團(tuán)，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)包裹[4]。

豬源抗菌肽主要包括防御素(defensins)和cathelicidins兩大家族，目前已發(fā)現(xiàn)了約30種豬源抗菌肽，其中Cathelicidins有PR-39、PG1-5(protegrin)、PF1-2(prophenin)和PMAP等4類抗菌肽[1]。cathelicidins基因由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成，1～3個(gè)外顯子編碼N-端信號(hào)肽區(qū)域(PRE)和保守的cathelin區(qū)域(PRO)，第4個(gè)外顯子編碼Pro區(qū)的最后幾個(gè)殘基和高度特異的C-端成熟肽區(qū)域。與其他抗菌肽相比，cathelicidins家族的抗菌活性更強(qiáng)[5-6]，抗菌作用迅速[7]，對(duì)耐藥菌株也具有較強(qiáng)的活性[8]、低的溶血活性以及細(xì)胞毒性，在新型抗菌藥物開發(fā)領(lǐng)域顯示出巨大的潛力[9]。

豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是豬的一種高度傳染性疾病，最早在北美洲和歐洲發(fā)現(xiàn)，我國于1955年首次分離到豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)。PRRSV可引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎及產(chǎn)弱仔等繁殖障礙，并可引起各年齡階段豬的呼吸道癥狀，仔豬死亡率高，同時(shí)還會(huì)導(dǎo)致免疫抑制和持續(xù)性感染等癥狀。PRRSV對(duì)我國乃至世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，已成為嚴(yán)重威脅養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要傳染病之一，而現(xiàn)有疫苗及藥物效果均不理想[10]。本試驗(yàn)主要研究豬感染PRRSV后體內(nèi)cathelicidins抗菌肽的表達(dá)情況，為PRRSV新藥物的開發(fā)提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 PRRSV由國家野生動(dòng)物疫病研究中心保存，PRRSV感染1月齡無特定病原體(SPF)豬(24頭)，分別于感染后12、24、72、168 h取樣(以未感染病毒的1月齡SPF豬6頭作為對(duì)照)，取肺臟、肺門淋巴結(jié)、脾臟、肝臟、骨髓等組織，將樣品置于凍存管中，液氮速凍，-80 ℃保存。

1.1.2 試劑 超純RNA提取試劑盒(Ultrapure RNA Kit)，購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；SupermoⅢM-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；dNTP Mixture、Ribonuclease Inhibitor和Oligo(dT)18Primers，購自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)；TransStart Green qPCR SuperMix，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取及cDNA的合成 采用超純RNA提取試劑盒(Ultrapure RNA Kit)取凍存組織進(jìn)行總RNA提取，操作過程按照試劑盒說明書進(jìn)行。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的質(zhì)量，紫外分光光度計(jì)下測(cè)定RNA濃度，隨后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈。以合成的cDNA作為Real-Time PCR(即實(shí)時(shí)定量PCR)分析的模板，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 Real-Time PCR Real-Time PCR(實(shí)時(shí)定量PCR)引物(由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成)序列[1，11]見表1，按照北京全式金生物技術(shù)有限公司TransStart Green qPCR SuperMix說明書進(jìn)行Real-Time PCR，反應(yīng)體系：P10.5 μL，P20.5 μL，2×TransStartTMGreen qPCR SuperMix 12.5 μL，Passive Reference Dye 0.5 μL，模板1.0 μL，ddH2O 10.0 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)。相對(duì)定量分析參照2-ΔΔCT法[12]。實(shí)時(shí)定量PCR分析共進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

表1 Cathelicidin引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 PR39的表達(dá)情況

豬感染PRRSV之后，在脾臟、肺、肺門淋巴結(jié)中均檢測(cè)到PR39的表達(dá)，且隨著感染時(shí)間的增長，表達(dá)量也有所變化。如圖1所示，豬感染PRRSV后，PR39在脾臟中的表達(dá)量在 0.5、1、3和7 d的4個(gè)感染時(shí)間段中，感染1 d后表達(dá)量最高，其次為感染0.5 d；豬感染PRRSV后，PR39在肺中的表達(dá)量在0.5、1、3和7 d的4個(gè)感染時(shí)間段中，感染1 d后表達(dá)量最高，其次為感染3 d；豬感染PRRSV后，PR39在肺門淋巴結(jié)中的表達(dá)量在0.5、1、3和7 d 4個(gè)感染時(shí)間段中，在感染1 d后表達(dá)量最高，然后依次是感染0.5、3、7 d，但感染0.5 d和 3 d 后的表達(dá)量差異不大。

綜上所述，豬感染PRRSV后，PR39在肺、肺門淋巴結(jié)和脾臟3種組織中的表達(dá)量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，且都是在感染1 d后表達(dá)量達(dá)到最高值。

2.2 Progerin 1的表達(dá)情況

豬感染PRRSV之后，在脾臟、肺、肺門淋巴結(jié)中均檢測(cè)到Progerin1(PG1)的表達(dá)，感染時(shí)間不同，其表達(dá)量有所變化，但差異較小。如圖2所示，豬感染PRRSV后，Progerin1在脾臟中的表達(dá)量在0.5、1、3和7 d 4個(gè)感染時(shí)間段中，在感染 1 d 后表達(dá)量最高，其次為感染0.5、7、3 d；豬感染PRRSV后，Progerin1在肺中的表達(dá)量在0.5、1、3和7 d 4個(gè)感染時(shí)間段中，在感染1 d后表達(dá)量最高，其次為感染3、7、0.5 d；豬感染PRRSV后，Progerin1在肺門淋巴結(jié)中的表達(dá)量在0.5、1、3和7 d 4個(gè)感染時(shí)間段中，在感染1 d后表達(dá)量最高，然后依次是感染0.5、3、7 d。綜上所述，豬感染PRRSV后，Progerin1在脾臟、肺和肺門淋巴結(jié)3種組織中的表達(dá)量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，且都是在感染1 d后表達(dá)量達(dá)到最高值，Progerin1的表達(dá)量在3種組織中的變化均不明顯。

2.3 progerin 1-5的表達(dá)情況

豬感染PRRSV后，在脾臟、肺、肺門淋巴結(jié)中均檢測(cè)到Progerin1-5(PG1-5)的表達(dá)，在脾臟中表達(dá)量較高，而在肺與肺門淋巴結(jié)中表達(dá)量較少，隨著感染時(shí)間的增長，表達(dá)量也有所變化。如圖3所示，豬感染PRRSV后，progerin1-5在脾臟中的表達(dá)量在0.5、1、3和7 d 4個(gè)感染時(shí)間段中，在感染 1 d 后表達(dá)量最高，然后依次為0.5、7、3 d；豬感染PRRSV后，progerin1-5在肺中的表達(dá)量在0.5、1、3和7 d 4個(gè)感染時(shí)間段中，在感染1 d后表達(dá)量最高；豬感染PRRSV后，progerin1-5在肺門淋巴結(jié)中的表達(dá)量在0.5、1、3和7 d 4個(gè)感染時(shí)間段中，在感染1 d后表達(dá)量最高，然后依次是感染0.5、3、7 d，但感染3 d與7 d后的表達(dá)量差異不大。

綜上所述，豬感染PRRSV后，progerin1-5在脾臟、肺和肺門淋巴結(jié)3種組織中的表達(dá)量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，且都是在感染1 d后表達(dá)量達(dá)到最高值，其中在脾臟中的表達(dá)量變化較大，而在肺中的表達(dá)量變化不明顯。

2.4 PMAP23的表達(dá)情況

豬感染PRRSV之后，在脾臟中未檢測(cè)到PMPA23的表達(dá)，肺、肺門淋巴結(jié)中檢測(cè)到PMPA23的表達(dá)，且隨著感染時(shí)間的增長，肺、肺門淋巴結(jié)中PMAP23的表達(dá)量有所變化。如圖4所示，豬感染PRRSV后，PMAP23在肺、肺門淋巴結(jié)中的表達(dá)量在0.5、1、3和7 d 4個(gè)感染時(shí)間段中，在感染1 d后表達(dá)量最高，然后依次為感染0.5、3、7 d。

綜上所述，豬感染PRRSV后，PMAP23在肺、肺門淋巴結(jié)中的表達(dá)量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，且都是在感染1 d后表達(dá)量達(dá)到最高值。

3 討論

抗菌肽分子量小，大部分具有12～50個(gè)氨基酸，具有強(qiáng)堿性、熱穩(wěn)定性以及廣譜抗菌性等特點(diǎn)，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域受到廣泛的重視，全球科研人員對(duì)抗菌肽的作用機(jī)制、藥物療效、安全性等進(jìn)行了深入的研究，并且建立了抗菌肽數(shù)據(jù)庫(APD：http：//aps.unmc.edu/AP/main.php)[13]。目前，該數(shù)據(jù)庫已收錄2 700多種抗菌肽，其中272種抗菌肽來源于細(xì)菌，4種抗菌肽來源于古細(xì)菌，8種抗菌肽來源于原生生物、13種抗菌肽來源于真菌，335種抗菌肽來源于植物，2 043種抗菌肽來源于動(dòng)物。這些抗菌肽具有抗細(xì)菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生蟲、抗癌、抗原蟲等活性。

研究發(fā)現(xiàn)，多種抗菌肽具有抗病毒活性，如抗艾滋病病毒、皰疹病毒。LL-37是人體內(nèi)唯一的cathelicidins，通過直接的滅活試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LL-37可以顯著降低幾種病毒對(duì)人的感染[14-17]。動(dòng)物抗菌肽通過與病毒糖蛋白或細(xì)胞表面的病毒受體的相互作用，可以直接抑制病毒的感染，也可以通過激活其他抗病毒反應(yīng)來間接地抑制病毒感染[18]。

本試驗(yàn)測(cè)定了PRRSV在感染豬后的不同時(shí)間段內(nèi)，脾臟、肺、肺門淋巴結(jié)中cathelicidins表達(dá)量的變化情況。研究結(jié)果表明，PR39、PG1、PG1-5、PMAP23的表達(dá)受到PRRSV的影響，豬感染PRRSV后，脾臟、肺、肺門淋巴結(jié)中的PR39、PG1、PG1-5、PMAP23表達(dá)量上調(diào)，其中PRRSV對(duì)PR39與PG1-5表達(dá)量的影響較大。下一步工作合成PR39、PG1、PG1-5、PMAP23多肽，測(cè)定抗菌肽對(duì)PRRSV的滅活效果以及對(duì)細(xì)胞的毒性，為PRRSV新藥物的開發(fā)提供新的思路。

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