一株中華鱉氣單胞菌噬菌體的分離及功能鑒定

呂孫建， 劉 莉， 曹 錚， 盧淑娟， 林 鋒

(農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/浙江省魚類健康與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/浙江省淡水水產(chǎn)研究所，浙江湖州 313001)

中華鱉(Trionyxsinensis)，肉質(zhì)鮮美，具有較高的營(yíng)養(yǎng)及藥用價(jià)值，是東南亞國(guó)家的主要淡水水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物，在我國(guó)、日本等地區(qū)均有養(yǎng)殖，我國(guó)的中華鱉產(chǎn)量一直居世界產(chǎn)量之首[1-3]。近年來，高密度養(yǎng)殖導(dǎo)致的藥物濫用及養(yǎng)殖水質(zhì)惡化等原因引起中華鱉疾病(細(xì)菌病及病毒病等)頻發(fā)[4]，其中嗜水氣單胞菌等細(xì)菌性病害最為常見，目前已知的中華鱉細(xì)菌性病害包括紅脖子病、紅底板病、白底板病、腐皮病、癤瘡病、穿孔病、爛甲病等[5]。

嗜水氣單胞菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖中最為常見的條件致病菌，在大部分水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中均能檢測(cè)到該細(xì)菌。該細(xì)菌為多致病因素病原菌，具有較強(qiáng)的毒性，能夠釋放毒素(細(xì)胞毒性和細(xì)胞緊張性刺激物)、內(nèi)毒素(脂多糖)、蛋白酶、溶血素、腸毒素和各種酶。此外，這些毒力因子釋放還會(huì)引起宿主感染加重，從而加重疾病的爆發(fā)[2]。

目前，中華鱉細(xì)菌性病害常用抗生素藥物進(jìn)行預(yù)防和治療，但是抗生素藥物的大量使用產(chǎn)生了一系列嚴(yán)重的問題，如病原菌產(chǎn)生抗藥性、養(yǎng)殖水質(zhì)惡化和藥物殘留等[4]。近些年，這些藥物的選用主要是套用魚類用藥的使用標(biāo)準(zhǔn)，效果往往不理想，且抗生素的使用正在逐步禁止及規(guī)范[6]，目前亟須研發(fā)一種新型、有效且環(huán)保的治療制劑對(duì)中華鱉的疾病進(jìn)行有效預(yù)防及治療。

噬菌體(bacteriophage)是寄生于細(xì)菌、霉形體、螺旋體、放線菌以及藍(lán)細(xì)菌等中的一類病毒，亦稱細(xì)菌病毒[7-8]。噬菌體以細(xì)菌作為宿主，可以特異性地殺滅相應(yīng)的宿主菌，因此噬菌體是一種很有潛力的新型治療制劑。目前，噬菌體的研究已經(jīng)涉及醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、食品加工、廢水處理等行業(yè)，并獲得了可喜的成果，其中不乏在水產(chǎn)養(yǎng)殖應(yīng)用的成功案例[9-10]。李新宇等研究報(bào)道，國(guó)內(nèi)外關(guān)于噬菌體療法在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究結(jié)果表明，噬菌體可有效控制水體中的病原菌，包括副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)、哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)、變形假單胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)、嗜環(huán)弧菌(Vibriocyclitrophicus)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)等，適用范圍廣[11]。

本研究從中華鱉的養(yǎng)殖水體中分離氣單胞菌噬菌體1株，并通過電鏡觀察、序列測(cè)定及噬菌效果觀察研究其生物學(xué)特性及其對(duì)細(xì)菌的裂解作用，為今后利用該噬菌體作為替代抗生素的生物防控技術(shù)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 中華鱉 試驗(yàn)用發(fā)病中華鱉大小為100～200 g，試驗(yàn)前暫養(yǎng)7 d(暫養(yǎng)期間投喂甲魚飼料)，挑選裙邊有明顯潰爛的中華鱉用于試驗(yàn)。

1.1.2 菌株 試驗(yàn)所用嗜水氣單胞菌分離自中華鱉養(yǎng)殖池，副溶血性弧菌分離自南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖池。試驗(yàn)用細(xì)菌均保存于浙江省淡水水產(chǎn)研究所。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體的分離及鑒定

1.2.1.1 噬菌體的分離 嗜水氣單胞菌噬菌體的分離使用胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基，以中華鱉養(yǎng)殖塘中分離出的嗜水氣單胞菌為宿主菌，采用雙層平板分離法分離裂解性噬菌體。噬菌體出斑后挑斑用液體胰蛋白大豆瓊脂胨培養(yǎng)，重復(fù)以上過程直至純化。

1.2.1.2 噬菌體的電鏡觀察 采用磷鎢酸負(fù)染法。為了獲得背景清晰的圖片，應(yīng)濃縮和凈化噬菌體濃縮液。通常采用超速離心的方法沉降噬菌體顆粒。將增殖液經(jīng)過4 ℃、8 000 r/min 離心30 min，取上清液，再通過10 000g的離心力超速離心使噬菌體顆粒沉降，用適量的PBS緩沖液洗滌沉淀。

1.2.1.3 噬菌體的序列測(cè)定 采用隨機(jī)引物擴(kuò)增法獲得噬菌體的部分片段序列。具體步驟是取中華鱉養(yǎng)殖池塘水，12 000 r/min 離心20 min；取上清液0.22 μm過濾，提取濾液DNA。以該DNA為模板，94 ℃變性3 min，冰上冷卻 2 min，加入0.5 μL 3′-5′ exo-Klenow DNA Polymerase后置于 37 ℃ 水浴1 h，重復(fù)1次變性、退火及延伸過程，將DNA補(bǔ)平。雙鏈DNA補(bǔ)平反應(yīng)體系為10×Klenow Buffer 3 μL，dNTP(2.5 mM)4 μL，F(xiàn)R26RV-N引物(GCCGGAGCTCTGCA GATATCNNNNNN)2 μL，DNA模板3 μg，3′-5′exo-Klenow DNA Polymerase總用量1 μL，加水補(bǔ)足反應(yīng)總體系達(dá)30 μL，反應(yīng)產(chǎn)物作為后續(xù)擴(kuò)增模板。

上述合成的雙鏈cDNA和補(bǔ)平的雙鏈DNA應(yīng)用FR20 RV(GCCGGAGCTCTGCAGATATC)單引物進(jìn)行隨機(jī)PCR擴(kuò)增，取5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)后，其產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后，用限制性內(nèi)切酶EcoRV將引物切除。酶切反應(yīng)體系為25 μL，其中純化的PCR產(chǎn)物20 μL，EcoRV 2.5 μL，Buffer 2.5 μL。反應(yīng)條件為37 ℃，作用時(shí)間 3 h。酶切產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠的條件下進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切取DNA大小范圍在600～1 500 bp的凝膠回收目的片段。

將回收的DNA片段和pSIMPLE 18 EcoRV/BAP Vector(Takara)連接并轉(zhuǎn)化，挑取單克隆進(jìn)行PCR鑒定，篩選 500 bp 以上片段大小不等的96個(gè)陽性克隆進(jìn)行測(cè)序。測(cè)得的序列拼接后去除載體序列，并在NCBI數(shù)據(jù)庫中應(yīng)用Blastn工具進(jìn)行核苷酸序列比對(duì)。

1.2.2 噬菌體應(yīng)用效果評(píng)估

1.2.2.1 噬菌體對(duì)細(xì)菌的裂解效果 采用雙層平板法和滴注法觀察噬菌體的噬菌效果。雙層平板法：首先配制2% LB瓊脂培養(yǎng)基和0.7%半固體LB培養(yǎng)基，將融化后的2% LB培養(yǎng)基傾注培養(yǎng)皿底層，凝固后為底層培養(yǎng)基，將0.7%半固體培養(yǎng)基融化后于42 ℃保溫，再將一定量的噬菌體分別與嗜水氣單胞菌和副溶血弧菌混合，吸附20～30 min后，與半固體培養(yǎng)基混合，傾注在底層培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)6～8 h后，觀察噬菌斑。滴注法：首先用涂布法將宿主菌涂滿整個(gè)平板，待平板表面風(fēng)干3～5 min后，再在平板上滴加5 μL噬菌體液，28 ℃培養(yǎng)8～12 h后，觀察噬菌效果。

1.2.2.2 噬菌體對(duì)中華鱉腐皮病的治療 培養(yǎng)新鮮氣單胞菌菌液至D550 nm為0.25，加入MgCl2使之終濃度達(dá)4 mmol/L，靜置吸附20～30 min，搖5 h后收獲。將培養(yǎng)液移入離心管中，以10 000 r/min離心10 min，以沉淀寄主細(xì)菌；將上清液移至新管中，以0.22 μm孔徑的過濾器去除殘余菌體，即得不含寄主細(xì)菌的噬菌體原液，采用雙層平板法測(cè)定其效價(jià)。將已患腐皮病中華鱉(100～200 g)放入水中，每4 L水中潑灑1×109噬菌體液10 mL，1次/2 d，5～7 d后觀察中華鱉。

2 結(jié)果與分析

2.1 噬菌體序列分析

本研究利用隨機(jī)引物擴(kuò)增方法得到隨機(jī)片段92段，其中與其他細(xì)菌同源或未知的序列72段，與噬菌體同源的序列20段。與噬菌體同源的20段部分序列的比對(duì)結(jié)果均顯示與氣單胞菌噬菌體有較高同源性，核酸片段序列最低相似度(NCBI BlastN identity score)為61%，最高相似度達(dá)到95%。表1列舉了相似度最高的4段片段的測(cè)序結(jié)果。表1、圖1顯示，前2段序列與氣單胞菌噬菌體Aes012的序列極為相似，第3段與4段分別與氣單胞菌噬菌體Aes508和31極為相似。

2.2 噬菌體電鏡觀察

本研究通過電子顯微鏡觀察噬菌體，并結(jié)合《病毒分類——國(guó)際病毒分類委員會(huì)第9次報(bào)告》，發(fā)現(xiàn)從甲魚養(yǎng)殖水體中分離得到的噬菌體為尾噬菌體目肌尾噬菌體科噬菌體。圖2中黃色箭頭所指的為噬菌體。該噬菌體頭部呈廿面體，為60～145 nm，并伴有長(zhǎng)短不一的尾巴(80～455 nm)。

2.3 噬菌體對(duì)細(xì)菌的裂解效果

本試驗(yàn)采用雙層平板法及滴注法檢測(cè)該噬菌體對(duì)嗜水氣單胞菌及副溶血弧菌的裂解效果，圖3-A為雙層平板法培養(yǎng)的嗜水氣單胞菌添加噬菌體6 h后的結(jié)果，圖3-B和圖 3-C 分別為嗜水氣單胞菌和副溶血弧菌滴加噬菌體 8 h 后的結(jié)果。圖中可見明顯的噬菌斑，說明該噬菌體對(duì)這2類細(xì)菌均有較好的裂解效果。

表1 氣單胞菌噬菌體部分片段的序列

2.4 噬菌體對(duì)中華鱉腐皮病的治療

用重新培養(yǎng)的噬菌體治療患腐皮病裙邊潰爛的中華鱉，經(jīng)5 d連續(xù)治療后，鱉裙邊的腐爛創(chuàng)口開始結(jié)痂并脫落，傷口逐漸愈合，說明該噬菌體對(duì)中華鱉的腐皮病有較好的治療效果。

3 討論

本研究成功從中華鱉養(yǎng)殖塘中分離得到噬菌體1株，經(jīng)過序列比對(duì)確定為氣單胞菌噬菌體，且為肌尾噬菌體科。目前，已從養(yǎng)殖用水中分離得到多株肌尾噬菌體并成功應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物病害防控，Jun等分離得到2株肌尾噬菌體(pAh1-C和pAh6-C)并用于泥鰍細(xì)菌病的防控，Silva等分離得到1株肌尾噬菌體(Phage AS-A)并用于塞內(nèi)加爾鰨細(xì)菌病的防控[12-13]。

噬菌體作為細(xì)菌的天敵，具有特異性強(qiáng)、見效快、無毒害、無污染的特點(diǎn)，受到人們的高度關(guān)注，并已成功應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)以及食品加工儲(chǔ)藏等領(lǐng)域[9]。已有研究發(fā)現(xiàn)，噬菌體在水產(chǎn)動(dòng)物疾病防控中能夠有效控制多種致病菌，例如副溶血弧菌、嗜水氣單胞菌、哈維弧菌、變形假單胞菌等。Mateus等發(fā)現(xiàn)3種可特異性裂解副溶血弧菌的噬菌體(VP-1，VP-2和VP-3)，并發(fā)現(xiàn)2～3種噬菌體混合使用，對(duì)弧菌的抑制效果優(yōu)于單獨(dú)使用[14]；胡蝶等制備副溶血弧菌噬菌體微膠囊，并與飼料一起投喂方斑東風(fēng)螺(Babyloniaareolata)，發(fā)現(xiàn)東風(fēng)螺腸道宿主菌平均比對(duì)照組減少96%，水體中宿主菌減少72%[15]；王志麗、Jun等分別從中華鱉及漢河中分離得到噬菌體，對(duì)嗜水氣單胞菌有明顯的裂解作用[12，16]。

本研究分離得到的氣單胞菌噬菌體對(duì)多種病原菌具有良好的裂解作用，通過雙層平板法和滴注法發(fā)現(xiàn)該噬菌體能夠有效抑制副溶血弧菌和嗜水氣單胞菌，并形成明顯的噬菌圈。通過動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該噬菌體對(duì)中華鱉的腐皮病具有良好的治療效果，水體添加噬菌體液后，發(fā)病甲魚體表潰爛部位明顯結(jié)痂脫落并愈合。在其他研究中，同樣發(fā)現(xiàn)噬菌體能夠有效抑制水產(chǎn)動(dòng)物病原。哈維弧菌和黃海希瓦式菌是引起水產(chǎn)魚類、蝦、刺參等動(dòng)物腐皮病的主要病原，Karunasagar等通過對(duì)哈維弧菌感染的對(duì)蝦注射2株不同的噬菌體，對(duì)蝦存活率分別為88%和86%，明顯高于注射抗生素的對(duì)蝦[17]；李新宇等證明噬菌體可有效抑制黃海希瓦式菌，顯著提高刺參的存活率[18]。此外，目前已報(bào)道的噬菌體多對(duì)單一細(xì)菌有抑菌作用，本次分離的噬菌體具有廣譜的抑菌效果，為寬噬噬菌體，不僅對(duì)中華鱉池塘分離的嗜水氣單胞菌有很強(qiáng)的抑制效果，對(duì)對(duì)蝦發(fā)病塘分離的副溶血弧菌也有較好的治療效果。

綜上，本次從中華鱉分離的噬菌體為肌尾噬菌體科寬噬噬菌體，對(duì)嗜水氣單胞菌和副溶血弧菌均有較好的抑制效果，且對(duì)中華鱉腐皮病有明顯的治療效果。本研究為噬菌體作為替代抗生素在中華鱉細(xì)菌病防控中的應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)，后續(xù)將進(jìn)一步開展規(guī)?；苽浼吧a(chǎn)評(píng)估試驗(yàn)等研究。

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