石慧，謝靜，宋宏偉，閆廣利，韓瑩，孟祥才,王喜軍

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究中心 國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥血清藥物化學(xué) 重點(diǎn)研究室 中美中醫(yī)方證代謝組學(xué)技術(shù)合作中心，黑龍江 哈爾濱 150040)

參白方是曹洪欣教授在經(jīng)典名方升陷湯的基礎(chǔ)上，根據(jù)臨床癥候特征進(jìn)行加減化裁而成，由黃芪、人參、白茅根等藥材組成，具有益氣升陷、活血化痰、滋陰清熱、養(yǎng)心安神的作用，主治大氣下陷型病毒性心肌炎后遺癥[1]。參白方的含量測(cè)定方法至今沒(méi)有明確報(bào)道。通過(guò)查閱文獻(xiàn)，參白方的主要化學(xué)成分有皂苷類成分，如黃芪甲苷、人參皂苷、柴胡皂苷、麥冬皂苷等，并且都具有治療病毒性心肌炎的作用[2-4]。白茅根為 禾 本 科 植 物 白 茅ImperatacylindricaBeauv.var. major(Nees)C. E. Hubb.的干燥根蓮，具有涼血止血，清熱利尿的功效[5]，在參白方中為君藥，與苦參相配利尿強(qiáng)心，調(diào)整心律。白茅根的質(zhì)量控制通常以白茅素和蘆竹素為指標(biāo)性成分[6],然而這兩種成分在禾本科竹亞科植物中普遍存在；部分研究以綠原酸作為白茅根質(zhì)量控制成分[7]，但其專屬性較差。研究表明各地白茅根藥材均可檢測(cè)到4 , 7-二甲氧基-5-甲基-香豆素(Siderin),而混淆品卻檢測(cè)不到[8]，因此本實(shí)驗(yàn)白茅根的指標(biāo)成分選用Siderin。本研究以參白方中君藥人參和白茅根的主要成分為指標(biāo)性成分，采用UPLC-MS/MS MRM模式測(cè)定參白方中人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、Siderin以及人參皂苷Rb1的含量，為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

美國(guó)Waters AcquityTMUPLC液相色譜儀(四元梯度泵-在線真空脫氣機(jī)-自動(dòng)進(jìn)樣器-二極管陣列檢測(cè)器-柱溫箱)；美國(guó)Waters TQD 電噴霧三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀；MassLynx V4.1工作站；KQ-500DB超聲波清洗器。

1.2 試劑與藥品

甲醇(色譜級(jí)，德國(guó)Merck公司)；蒸餾水(中國(guó)廣州屈臣氏食品飲料有限公司)；甲酸(色譜級(jí)，中國(guó)天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)，甲醇(分析級(jí)，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)。

黃芪(產(chǎn)地內(nèi)蒙、生產(chǎn)批號(hào)1405017S)；人參(產(chǎn)地東北、生產(chǎn)批號(hào)141026)；白茅根(產(chǎn)地河北、、生產(chǎn)批號(hào)140320)；柴胡(產(chǎn)地甘肅、生產(chǎn)批號(hào)141104)；升麻(產(chǎn)地吉林、生產(chǎn)批號(hào)140516)；苦參(產(chǎn)地黑龍江、生產(chǎn)批號(hào)1401027S)；麥冬(產(chǎn)地四川、批號(hào)140831)；桔梗(產(chǎn)地河北、生產(chǎn)批號(hào)140831)；茯苓(產(chǎn)地甘肅、生產(chǎn)批號(hào)140418)；赤芍(產(chǎn)地內(nèi)蒙、生產(chǎn)批號(hào)140510)；甘草(產(chǎn)地內(nèi)蒙、生產(chǎn)批號(hào)141030)。依據(jù)2010版《中國(guó)藥典》對(duì)處方各藥材進(jìn)行鑒定與檢驗(yàn)均為正品。

人參皂苷Rg1(110703-201529)，人參皂苷Rb1(110704-201424)，均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；人參皂苷Re(201005)，購(gòu)于四川省維克奇生物科技有限公司； Siderin(自制)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Waters ACQUITY UPLCTM HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸甲醇，B為0.1%甲酸水；梯度洗脫程序：0～1 min，55%～75% A；1～3 min，75%～100% A；3～5 min，100%～100% A；5～5.1 min，100%～55% A；5.1～8 min，55%～55% A。柱溫：40℃；樣品倉(cāng)溫度預(yù)設(shè)：4℃；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣體積：2 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

采用正離子檢測(cè)模式，電噴霧電離源，毛細(xì)管電壓：3.00 kv；錐孔采樣電壓：30 v；錐孔提取電壓：3.0 v；去溶劑氣溫度：350℃；去溶劑氣流量：600 L/hr；碰撞氣流量：50 L/hr；離子源溫度：110℃；掃描模式：MRM模式，各化合物質(zhì)譜信息見表1，UPLC MS/MS 圖譜見圖1。

表1 參白方指標(biāo)成分含量測(cè)定質(zhì)譜采集離子信息

圖1 人參皂苷等供試品溶液UPLC-MS/MS MRM色譜圖1:人參皂苷Re；2：人參皂苷Rg1；3：Siderin; 4:人參皂苷Rb1

2.3 溶液配制

2.3.1 供試品溶液的制備

按處方比例取藥材，先加9倍量70%乙醇浸泡1 h，回流提取1 h，濾過(guò)，藥渣再加8倍量70%乙醇提取1 h，合并濾液，濃縮，減壓干燥，得處方提取物。精密稱取提取物1 000 mg于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱重，超聲60 min，稱定重量，補(bǔ)足失重，過(guò)0.22 μm微孔濾膜于進(jìn)樣杯中，供UPLC檢測(cè)。

2.3.2 陰性樣品制備

分別按“2.3.1供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法制備缺少人參，白茅根的陰性樣品溶液。

2.3.3 對(duì)照品溶液的制備

分別精密取人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、Siderin以及人參皂苷Rb1對(duì)照品適量，加甲醇分別配制成對(duì)照品溶液；分別精密取人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、Siderin以及人參皂苷Rb1對(duì)照品溶液130 μL，320 μL，220 μL，320 μL于25 mL容量瓶中，得到濃度分別5.267 6，10.982 4，0.877 4，17.152 μg/mL的混標(biāo)儲(chǔ)備液。

2.4 專屬性

按照處方比例及工藝，分別制備缺少單味藥材人參、白茅根的陰性樣品，并按 “供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。取對(duì)照品溶液、供試品溶液和各陰性樣品溶液，按照色譜和質(zhì)譜條件方法進(jìn)樣分析，專屬性良好。

2.5 線性關(guān)系考察

取2.3.3項(xiàng)下混標(biāo)儲(chǔ)備液1，3，5，7，7.5 mL分別于10 mL容量瓶中，甲醇定容，得標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照品溶液。分別進(jìn)樣測(cè)定，以各物質(zhì)特征碎片離子峰面積(y)對(duì)被測(cè)組分的質(zhì)量濃度(x，μg/mL)進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍。結(jié)果見表2。

表2 參白方指標(biāo)成分標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.6 精密度考察

按2.3.1供試品溶液制備方法制備溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰的峰面積。測(cè)得人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、Siderin以及人參皂苷Rb1的峰面積RSD值分別為1.28%、1.30%、2.73%、1.21%，表明該方法精密度良好。

2.7 重復(fù)性考察

按2.3.1供試品溶液制備方法制備溶液，平行制備6份，檢測(cè)，記錄色譜峰的峰面積，計(jì)算各指標(biāo)成分的平均含量。測(cè)得人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、Siderin以及人參皂苷Rb1的平均含量分別為32.39、63.94、6.52、75.09 μg/g，RSD值分別為0.68%、0.68%、2.90%、1.49%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性考察

按2.3.1供試品溶液制備方法制備溶液，分別于0，2，4，6，8，10，12 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，測(cè)得人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、Siderin以及人參皂苷Rb1的峰面積RSD分別為2.67%、2.63%、3.90%、2.16%，表明供試樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 回收率考察

取已知含量處方提取物，精密稱定，加入對(duì)照品溶液適量，按2.3.1供試品溶液制備方法制備溶液，平行制備6份，檢測(cè)，各成分的回收率分別在99.86%～100.97%， RSD 0.91%～2.74%。結(jié)果見表3。

表3 參白方指標(biāo)成分回收率試驗(yàn)結(jié)果

表4 參白方指標(biāo)成分含量測(cè)定結(jié)果(μg/g)

2.10 樣品測(cè)定

按照2.3.1項(xiàng)下的參白方提取物制備方法制備3批樣品，然后按照供試品溶液制備方法制備供試品溶液，進(jìn)樣檢測(cè)，對(duì)各指標(biāo)成分進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見表4。

3 討論

參白方的含量測(cè)定方法目前尚未有研究，實(shí)驗(yàn)前期曾嘗試采用高效液相色譜法對(duì)參白方中的有效成分進(jìn)行含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)存在各成分相互干擾，分離度差，樣品溶液制備方法繁瑣等問(wèn)題，因此采用UPLC-MS/MS法建立參白方含量測(cè)定方法。UPLC-MS/MS 法具有高選擇性、高靈敏度，分析速度更快等特點(diǎn)，利用三重四級(jí)桿質(zhì)譜的MRM(多通道離子檢測(cè))模式，可以排除背景干擾，并且不要求被測(cè)成分完全分離，因此選用UPLC-MS/MS對(duì)參白方有效成分進(jìn)行含量測(cè)定。本方法可在短時(shí)間內(nèi)快速分離檢測(cè)參白方中人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、Siderin以及人參皂苷Rb1 4 種主要成分，該方法經(jīng)過(guò)考察，準(zhǔn)確，快捷，重復(fù)性好，符合中藥制劑的相關(guān)分析要求，可用于參白方的質(zhì)量控制。

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