王中華 何秉淑 孫成龍 宋肖煒 賀玖明 張瑞萍 再帕爾·阿不力孜*,

1(中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，生物成像與系統(tǒng)生物學(xué)研究中心， 北京 100081) 2(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室， 北京 100050)

1 引 言

質(zhì)譜成像(Mass spectrometry imaging，MSI) 是將成像處理軟件與質(zhì)譜的離子掃描技術(shù)相結(jié)合的一種新型成像方法，可在分子水平上對生物組織內(nèi)的分子“直接”分析，獲取其含量和空間分布信息[1,2]。腎臟是重要的代謝和排泄器官，小分子代謝物代謝異常在糖尿病腎病等多種腎病的發(fā)生過程中具有重要作用，全面了解其在腎臟組織中的含量及分布特征，有助于揭示腎臟疾病的發(fā)病機制、發(fā)現(xiàn)具有組織特異性的生物標(biāo)志物[3～5]。目前，MSI技術(shù)主要包括以下三大類型: 需要在真空條件下進行離子化的二次離子質(zhì)譜(SIMS)， 基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)質(zhì)譜，以及近幾年發(fā)展起來的以解吸電噴霧電離(DESI)為代表的敞開式離子化質(zhì)譜成像技術(shù)等[6～10]。其中，SIMS成像技術(shù)主要應(yīng)用于樣品表面的元素分析。MALDI-MSI是最成熟、應(yīng)用最為廣泛的質(zhì)譜成像技術(shù)，尤其適用于蛋白質(zhì)、多肽等生物大分子的成像分析[6,7]，近年來，隨著新型基質(zhì)的開發(fā)，其也被應(yīng)用在小分子成像分析領(lǐng)域。如Liu等[11]采用基于新型耐鹽基質(zhì)的MALDI-MSI質(zhì)譜成像技術(shù)研究了腎纖維化的發(fā)病機制，發(fā)現(xiàn)腎纖維化動物模型中與糖酵解、三羧酸循環(huán)、脂肪酸代謝、抗氧化劑等代謝網(wǎng)絡(luò)相關(guān)的21種小分子代謝物的含量及分布特征發(fā)生了顯著變化。與MALDI-MSI相比，DESI-MSI技術(shù)具有可在開放環(huán)境下操作、使用便捷，且樣品前處理簡單、無需添加基質(zhì)等優(yōu)點，在小分子代謝物成像分析方面具有廣闊的應(yīng)用前景[9,10]。如Dill等[12]采用DESI-MSI技術(shù)比較了乳頭狀腎細(xì)胞癌的癌組織與癌旁組織脂類代謝物的整體輪廓差異，結(jié)果表明，DESI-MSI技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計分析可準(zhǔn)確區(qū)分癌組織與正常組織，可應(yīng)用于疾病分子病理診斷。本課題組前期自主研發(fā)出新型敞開式空氣動力輔助離子化(Air flow assisted ionization, AFAI；或稱之為Air flow assisted desorption electrospray ionization, AFADESI；以下統(tǒng)稱為AFAI)及其免標(biāo)記、便捷、高靈敏的質(zhì)譜分子成像新技術(shù)(AFAI-MSI)，并成功應(yīng)用于候選新藥作用機制和腫瘤生物標(biāo)志物的原位篩查及免標(biāo)記分子病理診斷的研究[13,14]。本研究建立了基于AFAI-MSI技術(shù)檢測大鼠腎臟組織中小分子代謝物的分布特征的質(zhì)譜成像分析方法，為AFAI-MSI技術(shù)在腎臟疾病研究中的應(yīng)用提供了重要依據(jù)。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

AFAI-MSI成像系統(tǒng)平臺，采用Q Exactive型四極桿-靜電場軌道離子阱質(zhì)譜儀(美國Thermo Scientific公司)，拆卸原有商業(yè)離子源，通過自制離子源接口安裝AFAI 離子源，并配有Xcalibur 2.2數(shù)據(jù)采集與處理系統(tǒng)；UltiMate 3000系列超高效液相色譜儀(美國Thermo Scientific公司)，包括二元梯度泵、在線脫氣機、自動進樣器(配有恒溫箱)、柱溫箱、二極管陣列檢測器；CM 1860冷凍切片機(德國Leica Microsystem公司)。乙腈、異丙醇(色譜純，Merck公司)，實驗用水為某品牌純凈水。8周齡SD大鼠由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。

2.2 腎臟組織樣本的制備

將2只雌性SD大鼠于高濃度CO2條件下處死，立即摘取腎臟組織，用超純水沖洗掉外周血跡后迅速置于液氮中冷凍，于-80℃保存。

2.3 組織切片的制備

將組織從-80℃冰箱轉(zhuǎn)移至CM 1860冷凍切片機(操作溫度為-20℃)，連續(xù)獲取相鄰兩個厚度為8 μm的腎臟組織切片，分別置于兩個載玻片上，然后真空干燥30 min。

2.4 質(zhì)譜條件

采用正離子全掃描模式，掃描范圍為70～1000 Da，質(zhì)量分辨率設(shè)為70000，自動增益控制目標(biāo)值為3×106，最大注入時間為200 ms。噴霧電壓為7 kV，傳輸管電壓為3 kV，噴霧氣(氮氣)壓力為0.6 MPa，噴霧溶劑(異丙醇-乙腈-水，4∶4∶2，V/V)流速為5 μL/min，空氣輔助氣流速為45 L/min。數(shù)據(jù)采集采用Xcalibur 2.2軟件(美國Thermo Scientific公司)。

2.5 數(shù)據(jù)處理方法

利用Xcalibur 2.2軟件將原始數(shù)據(jù)文件轉(zhuǎn)換為cdf格式，隨后采用本課題組與科邁恩(北京)科技有限公司合作研制的質(zhì)譜成像軟件MassImager(質(zhì)譜成像系統(tǒng)工作站v1.0版)進行文件讀取，以檢測離子的種類、相對強度和空間位置，進行成像分析[15]。

3 結(jié)果與討論

3.1 溶劑的選擇

溶劑的極性、粘度、表面張力、介電常數(shù)等理化性質(zhì)是影響噴霧溶劑將目標(biāo)分子從組織內(nèi)萃取、解吸、電離的因素。采用甲醇、乙腈、異丙醇和水作為噴霧溶劑，以質(zhì)譜峰個數(shù)和強度為監(jiān)測指標(biāo)，分別對溶劑組成和比例進行了優(yōu)化。結(jié)果表明，采用乙腈-異丙醇-水(4∶4∶2,V/V)作為噴霧溶劑，對小分子代謝物的檢測效果最佳。

3.2 方法穩(wěn)定性考察

制備寬度和間隔均為3 mm的羅丹明B紅色條帶，對其進行AFAI-MS分析，以m/z443.2離子強度為監(jiān)測指標(biāo)，連續(xù)測定3天，考察了分析系統(tǒng)的穩(wěn)定性[16]。結(jié)果表明，m/z443.2離子峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative standard deviation，RSD)<20%，表明AFAI-MS分析方法的重復(fù)性良好。

3.3 AFAI-高分辨質(zhì)譜檢測分析

應(yīng)用空氣動力輔助離子化-超高分辨質(zhì)譜對腎臟組織冰凍切片進行了原位分析，結(jié)果表明，在正離子模式下能夠檢測到信號強度103～107的離子共498個(去除同位素)，檢測到的離子類型包括[M+H]+、[M+Na]+、[M+K]+、[2M+Na]+和[2M+K]+等。利用其精確質(zhì)荷比信息，在Metlin、HMDB、LIPID MAPS等數(shù)據(jù)庫中檢索可能的分子式及代謝物，結(jié)合同位素豐度比、不同類型加合離子之間的精確質(zhì)荷比差值以及文獻(xiàn)報道等信息，分析推測代謝物的可能結(jié)構(gòu)，共發(fā)現(xiàn)38種不同種類的內(nèi)源性代謝物(表1)。從表1可見，這些代謝物的分子量在100～900 Da之間均有分布，其質(zhì)量偏差均在5 ppm以內(nèi)，分別屬于有機胺、糖、神經(jīng)遞質(zhì)、維生素、多肽、有機酸、甘油磷脂、鞘脂、甘油脂、固醇酯等不同的代謝物類型，表明建立的基于超高分辨質(zhì)譜的AFAI-MS分析方法可適用于腎臟組織中含量差異較大的不同分子量和結(jié)構(gòu)類型的多種小分子代謝物的原位分析，并能獲得準(zhǔn)確的分子信息。

表1 從腎臟組織中發(fā)現(xiàn)的38種內(nèi)源性代謝物

Table 1 38 kinds of metabolites identified in rat kidney tissues

名稱aName實測質(zhì)荷比Measured(m/z)理論質(zhì)荷比Theoretical(m/z)質(zhì)量偏差bDeviationofmass(δ)分子離子Molecularions膽堿Choline104．1074104．10703．84[M+H]+甜菜堿Betaine118．0864118．08630．85[M+H]+?；撬酺aurine126．0221126．02200．79[M+H]+肌酐Creatinine136．0482136．04810．74[M+Na]+N?甲基尼克酰胺N?methylnicotinamide137．0710137．07090．73[M+H]+乙酰膽堿Acetylcholine146．1175146．1176-0．68[M+H]+肉堿Carnitine162．1124162．1125-0．62[M+H]+乙酰精氨Acetylspermidine188．1757188．17570．00[M+H]+甘油磷酸Glycerolphosphate195．0029195．00290．00[M+Na]+葡萄糖Glucose203．0526203．05260．00[M+Na]+山梨醇Sorbitol205．0683205．06830．00[M+Na]+磷酸膽堿Phosphocholine206．0552206．05520．00[M+Na]+泛酸PantothenicAcid242．0996242．0999-1．24[M+Na]+甘油磷脂酰乙醇胺Glycerylphosphorylethanolamine254．0189254．0190-0．39[M+K]+硫胺素Thiamine265．1115265．1118-1．13[M+H]+甘油磷脂酰膽堿Glycerophosphocholine280．0918280．0920-0．71[M+Na]+檸檬酸鈉Sodiumcitrate332．9559332．9571-3．60[M+K]+精氨酸?羥基天冬氨酸酸或羥基精氨酸?天冬氨酸酸Lys?Asp?OHorAsp?Lys?OH392．1052392．1064-3．06[M+Na]+1?(3?甲基丁?；??6?芹菜糖基葡萄糖1?(3?Methylbutanoyl)?6?apiosylglucose397．1707397．17050．50[M+H]+硬脂?；鈮AStearoylcarnitine428．3732428．3735-0．70[M+H]+MG(18∶0)381．2973381．2975-0．52[M+Na]+LysoPC(16∶0)518．3214518．3217-0．58[M+Na]+PC(18∶2)558．2952558．2956-0．72[M+K]+PC(18∶1)560．3102560．3112-1．78[M+K]+PC(20∶4)582．2960582．29560．69[M+K]+PG(22∶4)583．2990583．3006-2．74[M+Na]+PA(30∶0)607．4694607．4697-0．49[M+H]+CE(20∶4)695．5730695．5737-1．01[M+Na]+Cer(44∶1)700．6570700．6578-1．14[M+Na]+SM(34∶2)723．5405723．5411-0．83[M+Na]+SM(34∶1)739．5137739．5150-1．76[M+K]+PG(34∶1)771．5121771．5146-3．24[M+Na]+PE(38∶5)788．4958788．4990-4．06[M+K]+PG(36∶2)797．5277797．5302-3．13[M+Na]+PC(38∶5)804．4969804．49403．60[M+K]+SM(42∶3)833．6485833．6507-2．64[M+Na]+PC(40∶8)852．5501852．5514-1．52[M+Na]+LacCer(d32∶1)872．5490872．5495-0．57[M+K]+a，脂類化合物的簡稱：化合物名(碳原子數(shù)：雙鍵數(shù))，MG：甘油單酯，LysoPC：溶血磷脂酰膽堿，PC：磷脂酰膽堿，PG：磷脂酰甘油，PA：磷脂酸，CE：膽固醇酯，Cer：神經(jīng)酰胺，SM：鞘磷脂，PE：磷脂酰乙醇胺，LacCer：乳糖神經(jīng)酰胺。b，質(zhì)量偏差：質(zhì)量偏差=(實測質(zhì)量數(shù)-理論質(zhì)量數(shù))/理論質(zhì)量數(shù)×106。a，Abbreviationoflipidcompounds：Compoundname(NumberofCarbons：Numberofdoublebonds)，MG：Monoglycerides，LysoPC：Lyso?phosphatidylcholine，PC：Phosphatidylcholine，PG：Phosphatidylglycerol，PA：Phosphatidicacid，CE，Cholesterylester，Cer，Ceramide，SM：Sphingomyelin，PE：Phosphatidylethanolamine，LacCer：Lactosylceramide．b．Deviationofmass：Deviationofmass=(Measuredmass-the?oreticalmass)/Theoreticalmass×106．

3.4 代謝物的質(zhì)譜成像分析

膽堿及其代謝物在腎組織中的分布情況如圖1所示，膽堿是細(xì)胞膜、線粒體膜和神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的組成成分，參與脂代謝、信號傳導(dǎo)、生物分子的翻譯后修飾、核受體的激活、細(xì)胞膜的流動性調(diào)控等多種生命過程[17]。從圖1可見，膽堿在腎臟組織中分布廣泛，在腎皮質(zhì)和腎乳頭區(qū)域含量最高。

圖1 膽堿及其代謝物在大鼠腎組織中的分布: (A) 膽堿， (B) 乙酰膽堿， (C) 甜菜堿， (D) 磷酸膽堿， (E) 甘油磷酸膽堿Fig.1 Distribution of choline and its metabolites in rat kidney tissues: (A) Choline, (B) Acetylcholine, (C) Betaine, (D) Phosphocholine, and (E) Glycerophosphocholine

乙酰膽堿是膽堿在膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶的作用下合成的，可促進水和離子的排出。本研究發(fā)現(xiàn)乙酰膽堿主要分布于近髓皮質(zhì)區(qū)域，可能與膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶在腎皮質(zhì)集合管中的特異性分布有關(guān)[18]。

甜菜堿和甘油磷脂酰膽堿分別是膽堿的氧化和磷酸化代謝產(chǎn)物，分別在腎臟外髓質(zhì)和腎乳頭區(qū)域有特異性分布。據(jù)報道，甜菜堿和甘油磷脂酰膽堿是腎臟中重要的滲透保護劑，參與腎臟皮質(zhì)-髓質(zhì)軸向滲透壓梯度的形成，并且能夠?qū)垢吣蛩丨h(huán)境對腎髓質(zhì)細(xì)胞的損害作用，維持細(xì)胞內(nèi)生物大分子的正常結(jié)構(gòu)和功能[19]。甜菜堿在外髓質(zhì)區(qū)域含量很高，不僅可以檢測到[M+H]+、[M+Na]+、[M+K]+等準(zhǔn)分子離子，還能檢測到較強的 [2M+Na]+、[2M+K]+等準(zhǔn)分子離子峰，這些離子在腎臟組織中分布特征基本一致(圖2)。

圖2 甜菜堿的5種分子離子在大鼠腎組織中的分布: (A) [M+H]+，(B) [M+Na]+，(C) [M+K]+，(D) [2M+Na]+，(E) [2M+K]+Fig.2 Distributions of five molecular ions of betaine in rat kidney tissue: (A) [M+H]+, (B) [M+Na]+, (C) [M+K]+, (D) [2M+Na]+, (E) [2M+K]+

磷酸膽堿在皮質(zhì)和外髓質(zhì)部分具有少量分布，且主要分布在腎乳頭區(qū)域，推測其可能參與腎臟皮質(zhì)-髓質(zhì)軸向滲透壓梯度的形成。文獻(xiàn)[19]中曾將皮質(zhì)和髓質(zhì)分離，分別進行提取后， 再測定磷酸膽堿的含量，但未檢測到磷酸膽堿，推測可能與所采用的方法的靈敏度較低有關(guān)。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)了多種有機胺、糖、維生素、肉堿和有機酸類小分子代謝物在腎臟的不同組織區(qū)域呈特征性分布(圖3)，推測它們在腎臟細(xì)胞保護、滲透壓的調(diào)節(jié)、神經(jīng)遞質(zhì)代謝調(diào)控等方面具有重要作用[19～22]。例如，本研究發(fā)現(xiàn)硫胺素(維生素B1)主要分布在腎臟近髓皮質(zhì)部分，與乙酰膽堿具有相似的分布特征。有研究表明，維生素B1是乙酰膽堿代謝的重要調(diào)控因子，可抑制膽堿酯酶的活性，維生素B1的缺乏可導(dǎo)致此酶活性升高和乙酰膽堿的分解代謝增加，而補充維生素則可以提高乙酰膽堿的水平[22]。此外，維生素B1在體內(nèi)可轉(zhuǎn)變成硫胺素焦磷酸，參與糖在體內(nèi)的代謝。因此，維生素B1缺乏時，可導(dǎo)致糖代謝紊亂；而增加維生素B1的攝入可改善糖尿病導(dǎo)致的腎臟損傷，具有逆轉(zhuǎn)早期糖尿病、腎病的作用[23]。

圖3 有機胺、糖、維生素、肉堿和有機酸類代謝物在大鼠腎組織中的分布: (A) 肌酐，(B) N-甲基尼克酰胺，(C) 乙酰膽堿，(D) 精氨酸-羥基天冬氨酸酸或羥基精氨酸-天冬氨酸酸，(E) 甘油磷脂酰乙醇胺，(F) 葡萄糖，(G) 山梨醇，(H) 1-(3-甲基丁酰基)-6-芹菜糖基葡萄糖，(I) 甘油磷酸，(J) 檸檬酸鈉，(K) 硫胺素，(L) ?；撬?，(M) 泛酸，(N) 肉堿，(O) 硬脂酰基肉堿。Fig.3 Distribution of metabolites of organic amine, sugar, vitamins, peptides and organic acids in rat kidney tissues: (A) Creatinine, (B) N-methylnicotinamide, (C) Acetylspermidine, (D) Lys-Asp-OH or Asp-Lys-OH, (E) Glycerylphosphorylethanolamine, (F) Glucose, (G) Sorbitol, (H) 1-(3-Methylbutanoyl)-6-apiosylglucose, (I) Glycerol phosphate, (J) Sodium citrate, (K) Thiamine, (L) Taurine, (M) Pantothenic Acid, (N) Carnitine, (O) Stearoylcarnitine.

圖4是脂類代謝物在腎臟組織中的分布特征圖。脂類代謝物具有許多重要的生物學(xué)功能，參與調(diào)節(jié)多種生命活動過程，包括能量轉(zhuǎn)換、物質(zhì)運輸、信息識別與傳遞、細(xì)胞發(fā)育和分化、細(xì)胞凋亡等[24,25]。本研究建立的AFAI-MSI質(zhì)譜成像方法可檢測到溶血磷脂酰膽堿、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、甘油磷脂酸、鞘磷脂、神經(jīng)酰胺、甘油單酯、固醇酯等脂類代謝物。這些脂類代謝物在腎臟組織中呈不均勻分布，可能與腎臟組織不同區(qū)域具有不同的結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)。

圖4 脂類代謝物在大鼠腎組織中的分布: (A) LysoPC (16∶0)，(B) PC(18∶1)，C∶ PC(18∶2)，(D) PC(20∶4)，(E) PC(38∶5)，(F) PC(40∶8)，(G) PE(38∶5)，H∶ PG(22∶4)，(I) PG(34∶1)，(J) PG(36∶2)，(K) PA(30∶0)，(L) SM(34∶1)，M∶ SM(34∶2)，(N) SM(42∶3)，(O) Cer(44∶1), (P): LacCer(d18∶1/14∶0)， (Q) MG(18∶0)，(R) CE(20∶4)Fig.4 Distribution of lipids in rat kidney tissues: (A) LysoPC (16∶0), (B) PC(18∶1), (C) PC(18∶2), (D) PC(20∶4), (E) PC(38∶5), (F) PC(40∶8), (G) PE(38∶5), (H) PG(22∶4), (I) PG(34∶1), (J) PG(36∶2), (K) PA(30∶0), (L) SM(34∶1), (M) SM(34∶2), (N) SM(42∶3), (O) Cer(44∶1), (P) LacCer(d18∶1/14∶0), (Q) MG(18∶0), (R) CE(20∶4)

4 結(jié) 論

建立了基于空氣動力輔助離子化-高分辨質(zhì)譜技術(shù)檢測大鼠腎臟組織中小分子代謝物分布的質(zhì)譜成像分析方法。本方法無需樣品預(yù)處理, 靈敏度高，代謝物覆蓋范圍寬，可直接獲取多種類型、含量差異達(dá)4個數(shù)量級的內(nèi)源性代謝物的結(jié)構(gòu)、含量及空間分布信息。因此，本方法有望應(yīng)用于腎臟中內(nèi)源性代謝物的原位表征和代謝調(diào)控機制研究，為探究代謝物在糖尿病、腎病、慢性腎炎、急性腎衰等多種急慢性腎病中的作用等提供一種新的分析方法。

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