姜嵐 龐金環(huán) 肖偉烈 張國(guó)麗 劉俊 楊超

（1. 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，北京 100101；2. 云南大學(xué)教育部和云南省自然資源藥物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650091；3. 新疆農(nóng)墾科學(xué)院，石河子 832000）

由大麗輪枝菌（Verticillium dahliaeKleb.）引起的棉花黃萎病是我國(guó)棉花生產(chǎn)上的重要病害，嚴(yán)重影響棉花的產(chǎn)量，成為棉花可持續(xù)生產(chǎn)的主要障礙之一［1］。棉花黃萎病是一種土傳性的維管束真菌病害，防治難度較大。選育和種植抗性品種是目前防治棉花黃萎病的主要措施，但是存在選育周期長(zhǎng)及抗性不穩(wěn)定的缺點(diǎn)。市場(chǎng)上也存在抗棉花黃萎病的農(nóng)藥或混配殺菌劑，雖然可以在一定程度上有效防治棉花黃萎病，但是化學(xué)農(nóng)藥的大量使用會(huì)污染環(huán)境并危害人類(lèi)健康。此外，化學(xué)農(nóng)藥的使用也會(huì)增強(qiáng)病菌的抗藥性，并對(duì)田間其它有益微生物產(chǎn)生抑制作用［2］。為緩解農(nóng)藥殘留帶來(lái)的環(huán)境污染，滿(mǎn)足無(wú)公害農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)的需要，生物農(nóng)藥的研究與開(kāi)發(fā)已成為我國(guó)病蟲(chóng)害防治研究的熱點(diǎn)之一［3］。目前國(guó)內(nèi)已有少量利用中藥或植物提取物來(lái)防治棉花黃萎病的報(bào)道［4-6］，主要集中在抑制菌絲生長(zhǎng)、毒素分泌、孢子萌發(fā)和孢子產(chǎn)量等方面的研究。

本研究采用56種中藥提取物，通過(guò)生長(zhǎng)速率測(cè)定、莖稈切片觀(guān)察及防治效果分析，初步確定部分中藥提取物既可直接有效抑制大麗輪枝菌菌絲生長(zhǎng)又能提高棉花黃萎病的防治效果，旨為進(jìn)一步研發(fā)防治棉花黃萎病的新型生物農(nóng)藥提供線(xiàn)索和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試中藥提取物 供試中藥材來(lái)自于云南省藥材公司，藥材品名和對(duì)應(yīng)植物部位均為《中華人民共和國(guó)藥典》2015版規(guī)定藥材。取樣0.5-1.0 kg藥材，按藥材特性和比重，用1-2 L的玻璃層析柱進(jìn)行分離。洗脫溶劑體積為柱床體積的3倍，并將溶劑提取段按餾分順序分為前段、中段和后段，各為1倍柱床體積。洗脫液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮待用。

1.1.2 植物病原菌及植物材料 棉花黃萎病病原菌（大麗輪枝菌）為新疆農(nóng)墾科學(xué)院分子農(nóng)業(yè)技術(shù)育種中心鑒定的132T菌株。供試棉花品種為T(mén)M-1。

1.2 方法

1.2.1 中藥提取物抑菌活性測(cè)定 采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定中藥提取物對(duì)菌絲的生長(zhǎng)抑制作用。將56種中藥提取物用甲醇的水溶液溶解或懸浮成懸濁液，按比例加至PDA平板，使其終濃度分別為 1 g/L、10 g/L和20 g/L 3個(gè)梯度的質(zhì)量濃度。以添加水或等量百分比的甲醇水溶液的PDA培養(yǎng)基平板為對(duì)照。

將液態(tài)培養(yǎng)的大麗輪枝菌過(guò)濾并離心收集孢子，制成濃度為1×107個(gè)/mL的孢子懸浮液。吸取5 μL孢子溶液接種于PDA培養(yǎng)基中央，于28℃暗培養(yǎng)7 d。每個(gè)處理重復(fù)2次。采用十字交叉法測(cè)定菌落直徑，并計(jì)算抑菌率。

菌絲生長(zhǎng)抑制率（%）=（對(duì)照菌落生長(zhǎng)直徑-處理菌落生長(zhǎng)直徑）/對(duì)照菌落生長(zhǎng)直徑×100。

1.2.2 中藥提取物對(duì)棉花黃萎病防治效果調(diào)查 中藥提取物用DMSO溶解，再用0.1%的吐溫-80℃溶液稀釋到3 g/L質(zhì)量濃度。選取二葉一心期棉苗12株，將3 g/L的中藥提取物溶液噴霧到棉苗葉片表面，至葉面全部噴濕。葉面噴施5 mmol/L水楊酸作為陽(yáng)性對(duì)照［7］，噴施含DMSO的0.1% 土溫-80作為陰性對(duì)照。中藥提取物噴施后第3天進(jìn)行棉苗蘸根接菌，孢子懸浮液濃度為5×106個(gè)/mL。接菌2周后進(jìn)行病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)及防治效果分析。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。發(fā)病程度劃分為六級(jí)：1級(jí)（級(jí)值為0）：植株健康，葉片無(wú)發(fā)病癥狀；2級(jí)（級(jí)值為1）：子葉發(fā)病或脫落；3級(jí)（級(jí)值為2）：1片真葉發(fā)病或脫落；4級(jí)（級(jí)值為3）：2片真葉發(fā)病或脫落；5級(jí)（級(jí)值為4）：3片真葉發(fā)病或脫落；6級(jí)（級(jí)值為5）：4片以上真葉發(fā)病或脫落以及整株萎蔫或頂心枯死。計(jì)算公式分別為：

病情指數(shù)＝∑（各級(jí)植株數(shù)×對(duì)應(yīng)級(jí)值）/（植株總數(shù)×最高級(jí)值）；

防治效果＝［（負(fù)對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/負(fù)對(duì)照病情指數(shù)］×100%。

2 結(jié)果

2.1 中藥提取物對(duì)大麗輪枝菌的抑制活性篩選

采用生長(zhǎng)速率法，對(duì)56種提取物在質(zhì)量濃度分別為1、10 和20 g/L下進(jìn)行抑菌作用測(cè)定。如表1所示，在1 g/L濃度下抑菌率達(dá)到50%的中藥提取物有3種，分別為紅花木蓮氯仿段（50%，4號(hào)），華蓋木石油醚部分（57.1%，42號(hào)）和黃苞大戟正丁醇部位（53.6%，46號(hào)）。在10 g/L濃度下抑菌率達(dá)到50%以上的有26種，其中5種提取物的抑菌率達(dá)到了100%，分別為24、45、46、47和56號(hào)。在20 g/L濃度下抑菌率達(dá)到100%的提取物有18種，主要集中于五味子、鐵箍散、華蓋木、黃苞大戟、中平樹(shù)、大果大戟、尾葉血桐、栽秧花和盾葉木等植物提取物中。其中以五味子最為突出，鐵箍散和黃苞大戟次之。

表1 56種中藥提取物對(duì)大麗輪枝菌菌絲的生長(zhǎng)抑制作用

續(xù)表

2.2 中藥提取物對(duì)大麗輪枝菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

測(cè)定抑菌率時(shí)發(fā)現(xiàn)，在不同提取物不同濃度下，PDA培養(yǎng)基上大麗輪枝菌的菌絲生長(zhǎng)均受到不同程度的影響（圖1），可歸納為以下5種類(lèi)型：（1）在1 g/L濃度下已經(jīng)能夠明顯抑制菌生長(zhǎng)，但隨著濃度的提高抑菌活性變化并不大（如4號(hào)）；（2）在1 g/L濃度下抑菌作用明顯，但在10 g/L濃度下抑菌率達(dá)到100%（如46號(hào)）；（3）在1 g/L濃度下抑菌作用較弱，但在10 g/L濃度下抑菌率達(dá)到100%（如24號(hào)）；（4）濃度增加到20 g/L時(shí)表現(xiàn)出良好的抑菌效果（如7號(hào)、37號(hào)、49號(hào)、51號(hào)和54號(hào)）；（5）在所有濃度下都沒(méi)有明顯抑菌效果，菌絲生長(zhǎng)正常（如48號(hào)）。

圖1 代表性中藥提取物對(duì)大麗輪枝菌的抑制活性篩選

2.3 中藥提取物對(duì)棉花黃萎病的防治效果鑒定

從2.2中分類(lèi)的5種類(lèi)型中，隨機(jī)選取了13種中藥提取物對(duì)其防治效果進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。用3 g/L中藥提取物處理棉花植株，統(tǒng)計(jì)棉花黃萎病病情指數(shù)。由于不同批次實(shí)驗(yàn)條件的差異，病情指數(shù)不能直接用于比較，因此以每一批次的陰性對(duì)照病情指數(shù)為基準(zhǔn)計(jì)算防治效果進(jìn)行比較評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)部分中藥提取物對(duì)棉花本身存在一定的毒害作用，處理后植株表現(xiàn)出非病態(tài)的傷害表型，因此對(duì)其結(jié)果不做統(tǒng)計(jì)。如表2所示，在3 g/L的中藥提取物濃度下，2號(hào)、3號(hào)、12號(hào)和13號(hào)提取物防治效果較好且重復(fù)性良好，表明這些提取物對(duì)棉花黃萎病有明顯的防治效果。而其它提取物的防治效果較差（有的甚至為負(fù)值）或重復(fù)性差，說(shuō)明這些提取物雖然抑菌活性強(qiáng)，但對(duì)黃萎病的防治效果并不明顯。而黑龍江產(chǎn)五味子氯仿∶丙酮=3∶2段（13號(hào)）提取物的抑菌率在10 g/L和20 g/L濃度下分別為71.4%和100%，明顯高于黑龍江產(chǎn)五味子氯仿∶丙酮=10∶1段（16號(hào)）和紅花木蓮氯仿∶丙酮=40∶1段（3號(hào)）提取物（表1）。這說(shuō)明黑龍江產(chǎn)五味子的氯仿∶丙酮=3∶2段提取物不僅可以有效地抑制大麗輪枝菌的菌絲生長(zhǎng)，而且可以提高棉花黃萎病的防治效果。

2.4 黑龍江產(chǎn)五味子氯仿∶丙酮=3∶2段提取物對(duì)棉花黃萎病的抑制作用

為進(jìn)一步揭示黑龍江產(chǎn)五味子氯仿∶丙酮=3∶2段提取物對(duì)棉花黃萎病的抑制作用，采用質(zhì)量濃度為3 g/L的提取物處理二葉一心期棉花幼苗，并在接菌后2周進(jìn)行棉花莖稈切片觀(guān)察。如圖2-A所示，在對(duì)照植株中，大麗輪枝菌侵染導(dǎo)致明顯的維管束褐化。而在提取物處理的植株莖稈中，由病原菌引起的棉花維管束褐變程度得到有效緩解。觀(guān)察整體植株發(fā)現(xiàn)，提取物處理可以明顯緩解黃萎病引起的落葉癥狀（圖2-B）。以上結(jié)果表明，黑龍江產(chǎn)五味子氯仿∶丙酮=3∶2段提取物可能通過(guò)抑制病菌侵染維管束來(lái)提高棉花對(duì)于黃萎病的抗性作用。

表2 中藥提取物對(duì)黃萎病的防治效果測(cè)定

3 討論

3.1 中藥提取物對(duì)大麗輪枝菌的菌絲生長(zhǎng)有強(qiáng)烈的抑制作用

已有報(bào)道稱(chēng)部分中藥提取物可以有效抑制大麗輪枝菌的菌絲生長(zhǎng)，并且對(duì)馬鈴薯晚疫病、果蔬致腐真菌、芒果炭疽菌和蒂腐菌等具有較好的抑制效果［8-10］。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)26種中藥提取物對(duì)大麗輪枝菌有不同程度的抑制效果，其中五味子氯仿∶丙酮的不同比例提取段均具有良好的抑菌效果，在質(zhì)量濃度為10 g/L時(shí)抑菌率即可達(dá)到50%以上，而黑龍江產(chǎn)五味子（又稱(chēng)北五味子）效果最好。鐵箍散屬于五味子科五味子屬植物，該植物以根及葉入藥，可用于治療風(fēng)濕麻木、跌打損傷、胃痛和脈管炎等疾?。?1］。在本實(shí)驗(yàn)中，鐵箍散的乙酸乙酯部位和氯仿∶丙酮=1∶1段的兩種不同提取物對(duì)大麗輪枝菌菌絲生長(zhǎng)有較明顯的抑制作用。質(zhì)量濃度為10 g/L時(shí)，抑菌率分別為78.6%和82.1%。黃苞大戟作為一種植物藥材，主要用于腎炎水腫、腹脹、便秘、瘧疾、風(fēng)濕和黃疸等疾病治療［12］。楊大松等［13］對(duì)黃苞大戟的化學(xué)成分進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，其主要含有二萜、三萜和甾體等成分。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，黃苞大戟的乙酸乙酯和正丁醇部位的中藥提取物在10g/L的濃度下，對(duì)大麗輪枝菌的抑菌率即可達(dá)到100%。這為黃苞大戟作為植物源提取物的抗病機(jī)理的研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

圖2 黑龍江產(chǎn)五味子氯仿∶丙酮=3∶2段提取物對(duì)大麗輪枝菌引起的棉花黃萎病的抑制作用

3.2 同一種中藥提取物中可能存在多種對(duì)大麗輪

枝菌有抑制作用的活性成分本研究中，在中藥提取物質(zhì)量濃度為10 g/L時(shí)，遼寧產(chǎn)五味子氯仿∶丙酮=3∶2段、遼寧產(chǎn)五味子氯仿∶丙酮=1∶1段和遼寧產(chǎn)五味子氯仿∶丙酮=9∶1后段對(duì)大麗輪枝菌的菌絲生長(zhǎng)抑制率分別為82.1%、78.1%和64.3%。黑龍江產(chǎn)五味子氯仿∶丙酮=3∶2段和黑龍江產(chǎn)五味子氯仿∶丙酮=10∶1段的菌絲生長(zhǎng)抑制率分別為71.4%和57.1%。表明在同一植物中存在多種對(duì)大麗輪枝菌有活性抑制的成分，而且同一種中藥的不同產(chǎn)地也會(huì)影響抑菌效果。

3.3 黑龍江產(chǎn)五味子氯仿∶丙酮=3∶2段提取物對(duì)棉花黃萎病有較好的防治效果

實(shí)驗(yàn)中有26種中藥提取物對(duì)大麗輪枝菌的菌絲生長(zhǎng)表現(xiàn)出良好的抑制作用，但是在進(jìn)行病情指數(shù)和防治效果測(cè)定中發(fā)現(xiàn)，其對(duì)大麗輪枝菌的菌絲生長(zhǎng)抑制作用與防治效果并不一致。遼寧產(chǎn)五味子氯仿∶丙酮=3∶2段在10 g/L質(zhì)量濃度下菌絲生長(zhǎng)抑制率為82.1%，而防治效果為-109%，說(shuō)明該提取物雖然可以有效抑制大麗輪枝菌的菌絲生長(zhǎng)，但是在黃萎病防治效果方面較差。而黑龍江產(chǎn)五味子氯仿∶丙酮=3∶2段在10 g/L質(zhì)量濃度下菌絲生長(zhǎng)抑制率為71.4%，平均防治效果為68.5%。表明該提取物不僅可以有效抑制大麗輪枝菌的菌絲生長(zhǎng)，而且對(duì)棉花黃萎病有較好的防治效果。造成這種防治效果不同的原因或許是由于不同產(chǎn)地的五味子藥效成分的差異［14］，如南、北五味子其實(shí)不是同一種植物。

大麗輪枝菌侵染植物根部后，在適宜的環(huán)境下開(kāi)始侵染維管束，隨著病原菌的不斷積累和擴(kuò)展，感病植株開(kāi)始出現(xiàn)一系列發(fā)病癥狀，包括萎蔫、褪綠、黃化、組織壞死、生長(zhǎng)遲緩和維管束褐化［15-18］。通常認(rèn)為維管束變色說(shuō)明大麗輪枝菌已經(jīng)侵入植株，產(chǎn)生落葉癥狀的植株維管束褐化程度更高［19-20］。通過(guò)莖切片觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量濃度為3 g/L的黑龍江產(chǎn)五味子氯仿∶丙酮=3∶2段可以有效抑制黃萎病引起的維管束褐化，并且落葉癥狀得到明顯抑制。說(shuō)明該提取物可以誘導(dǎo)植株產(chǎn)生抗黃萎病效果。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為研究和開(kāi)發(fā)防治棉花黃萎病的新型生物農(nóng)藥提供了線(xiàn)索和依據(jù)。

4 結(jié)論

依據(jù)抑菌率、病情指數(shù)和防治效果的測(cè)定結(jié)果，黑龍江產(chǎn)五味子氯仿∶丙酮=3∶2段中藥提取物，不僅可以有效抑制大麗輪枝菌的菌絲生長(zhǎng)，而且可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生對(duì)黃萎病的抗性作用。

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