譚新偉 靳雨婷 劉美彤 王群青，2

（1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院 山東省農(nóng)業(yè)微生物重點實驗室，泰安 271018；2. 教育部農(nóng)作物生物災(zāi)害綜合治理重點實驗室 農(nóng)業(yè)部華東作物有害生物綜合治理重點實驗室，南京 210095）

大豆（Glycine max L.）是重要的油料和糧食作物，市場需求巨大。目前大豆產(chǎn)量的制約因素主要是氣候變化和病害［1］。大豆疫霉（Phytophthora sojae）引發(fā)的大豆疫病，又稱大豆疫霉根莖腐病，是大豆生產(chǎn)中的一種毀滅性病害，每年在全球范圍內(nèi)造成10-20億美元的經(jīng)濟損失［2］。生產(chǎn)中控制大豆疫病的主要方法是利用植物抗性進行抗病品種選育。為實現(xiàn)這一目標，在分子層面對大豆疫霉與大豆的相互作用進行深入的研究具有重要的理論價值和實踐意義［3］。目前對于大豆疫霉與大豆互作的研究主要集中在病原菌效應(yīng)分子毒性作用、寄主抗性及兩者之間的分子互作機制方面［4］，本文重點剖析目前大豆抗性產(chǎn)生和喪失的原因，探討了效應(yīng)分子的反識別分子策略，以及利用疫霉菌保守分子靶標設(shè)計開發(fā)新型抗病資源的可能性。

1 大豆疫霉與大豆疫病

由疫霉菌引起的大豆疫病于20世紀50年代在北美被發(fā)現(xiàn)，并因此確立了一個病原菌新種即大豆疫霉［5］。大豆疫霉是一類卵菌病原微生物，自然條件下僅能侵染大豆和羽扇豆［2，6］。大豆疫霉可為害大豆的整個生長期，包括出土前的爛種、幼苗爛苗及猝死、成株期根莖腐以及侵染葉片造成的黃化枯萎等［3］。大豆疫霉是一種兼性病原菌，在親和互作條件下侵染4 h后，侵入的菌絲不斷在寄主細胞間擴展，并形成多個吸器，獲取寄主的營養(yǎng)和水分［2］。侵染15 h后，感病寄主開始出現(xiàn)壞疽癥狀，說明大豆疫霉已經(jīng)由寄生階段向死體營養(yǎng)階段轉(zhuǎn)變［2］。

由于大豆疫霉侵染速度快，病程發(fā)展迅速，往往來不及施藥進行化學(xué)防治，因此大豆疫病是大豆生產(chǎn)上造成損失最嚴重，也是最難防治的病害之一［7］。大豆疫霉屬于卵菌而不是真菌，對很多殺菌劑不敏感，極難通過化學(xué)農(nóng)藥對其進行有效防治［2］。而且大豆疫霉及其代表的卵菌病原菌具有非常豐富的遺傳多樣性，在田間變異極其迅速，往往在很短的時間內(nèi)即可使化學(xué)農(nóng)藥喪失效果［8-9］。目前生產(chǎn)上防治大豆疫病主要依賴抗病育種［4］。大豆與大豆疫霉的互作符合基因?qū)蚣僬f，因此培育和種植抗病品種是最經(jīng)濟、安全、有效的防控策略。

大豆對大豆疫霉的小種?；钥剐允怯煽共。≧esistance to P.sojae，Rps）基因介導(dǎo)的免疫反應(yīng)限制大豆疫霉的侵染來實現(xiàn)的，迄今已鑒定并定名了13個Rps基因［2］。然而，田間大豆疫霉變異迅速，加之大多數(shù)品種抗源單一，在推廣8-15年后就會喪失原有的抗性［2］。以美國俄亥俄州為例，在1972年推廣抗病品種之前田間只發(fā)現(xiàn)1號生理小種，而隨后7年內(nèi)就鑒定出7個新生理小種，到1998年則增加至55個，同時有78.9%的田塊鑒定出有克服抗病基因的疫霉菌株［10］。目前所有已知抗病基因均被大豆疫霉菌“擊敗”，因此迫切需要拓寬新的抗病資源。

同時在田間還存在耐病性的品種，即大豆品種可以忍受一定程度的發(fā)病而造成有限的產(chǎn)量損失。耐病性由多基因控制，也稱部分抗性或數(shù)量抗性，對所有大豆疫霉的致病型均能夠產(chǎn)生作用，抑制病斑的擴展，在田間一般產(chǎn)量損失較少［10］。隨著田間抗病品種的推廣，病原菌的毒力型在選擇壓力下快速變異，造成質(zhì)量抗性的使用壽命縮短，因此具有廣譜抗性的耐病品種選育也越來越受到關(guān)注。

2 大豆與大豆疫霉相互識別的分子基礎(chǔ)

識別（Recognition）是植物-病原菌直接互作的最初階段［11］。大豆與大豆疫霉的相互識別，一方面是病原菌通過識別寄主的化學(xué)、電位及物理特征，開啟并控制侵染的過程；另一方面則是寄主通過識別病原菌相關(guān)分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）和效應(yīng)分子（Effectors），觸發(fā)一系列的免疫防衛(wèi)反應(yīng)［11-14］。

2.1 大豆疫霉特異性識別大豆

研究顯示，大豆疫霉游動孢子能被大豆或鷹嘴豆的根部分泌物如大豆異黃酮所吸引，這些分泌物即使被稀釋到500倍，仍然對游動孢子具有極強的吸引力［15-16］。Zhang等［17-18］的研究表明，大豆疫霉G蛋白α亞基PsGPA1及下游的互作蛋白PsHint1共同參與調(diào)控游動孢子對異黃酮物質(zhì)的趨化性，并且還控制附著胞形成、活性氧清除、效應(yīng)分子的轉(zhuǎn)錄及激發(fā)子類似基因的表達等一系列侵染過程。對大豆疫霉的一個G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptor，GPCR）蛋白PsGPR11的研究發(fā)現(xiàn)，其對游動孢子的游動時間、休止孢萌發(fā)及游動孢子致病性等都有顯著影響［19］。而對另外一個偶聯(lián)磷脂酰肌醇磷酸激酶PIPK的大豆疫霉GPCR蛋白PsGK4的研究也發(fā)現(xiàn)，其控制著游動孢子的休止及休止孢萌發(fā)［20］。這說明大豆疫霉的游動孢子在不斷的通過感知外界特別是寄主化學(xué)物質(zhì)的變化而調(diào)控自身的發(fā)育過程，包括休止和萌發(fā)。

游動孢子形成休止孢和隨后休止孢的萌發(fā)受到一系列環(huán)境因素的影響，如水流的擾動、大豆異黃酮刺激、根部物理表面以及鈣離子的或其它營養(yǎng)元素的接觸［21］。休止孢萌發(fā)后產(chǎn)生伸長的芽管，尋找到表皮細胞垂周壁之間的縫隙后開始侵入［22］。至于芽管是如何精確地找到侵入位點還沒有明確的研究結(jié)果，有一種可能性就是在垂周壁之間的結(jié)合處存在相對高濃度的某種化學(xué)物質(zhì)而使芽管具有向觸性［23］。一旦尋找到這樣一個侵入點，芽管就開始穿透寄主細胞壁，并在寄主細胞間形成侵染菌絲，通過菌絲的變態(tài)結(jié)構(gòu)吸器獲取水分和營養(yǎng)，進入病程快速發(fā)展的階段［2，23］。至此，大豆疫霉將按照固定的程序轉(zhuǎn)錄調(diào)控各種效應(yīng)分子，協(xié)同控制對寄主的侵染過程［13］。

2.2 大豆特異性識別大豆疫霉

大豆與大豆疫霉的互作符合基因?qū)蚣僬f，因此在育種上經(jīng)常利用這種小種水平的?；剐詠砼嘤共∑贩N。無論在親和互作還是在非親和互作條件下，大豆疫霉均可完成從游動孢子到形成吸器的侵入過程，但在抗病品種上不能進一步擴展［24］。植物防衛(wèi)反應(yīng)開啟的前提條件就是在侵染過程中識別到入侵的病原微生物，識別病原微生物也是植物先天免疫反應(yīng)中最基本和最重要的組成部分［11］?，F(xiàn)代分子植物病理學(xué)家提出了植物免疫系統(tǒng)理論，認為抗病植株通過識別PAMP或者效應(yīng)分子，開啟兩種不同層面的抗病反應(yīng)，即病原相關(guān)分子模式PAMP觸發(fā)的免疫反應(yīng)（PAMP-triggered immunity，PTI）和效應(yīng)子effector觸發(fā)的免疫反應(yīng)（Effectortriggered immunity，ETI）［12］。

2.2.1 大豆識別大豆疫霉的PAMP觸發(fā)PTI 病原相關(guān)分子模式PAMP是一類保守的病原分子，通常不能夠通過進化而退化或去除［12］。PAMP觸發(fā)的免疫反應(yīng)主要體現(xiàn)在植物的基礎(chǔ)抗性和非寄主抗性上。植物利用類似受體的蛋白激酶（Receptorlike proteins or -kinases，RLP/Ks）來感知病原微生物保守的PAMP分子［12］。疫霉菌的PAMP包括了很多蛋白、多糖及小分子物質(zhì)，往往可以激發(fā)寄主和非寄主植物的防衛(wèi)反應(yīng)，因此也被稱作激發(fā)子（Elicitor）［25］。例如，在疫霉菌中存在著一類保守的小分子甾醇結(jié)合蛋白，這些蛋白只有98個氨基酸大小，但卻是疫霉菌從植物中獲取甾醇所必須的。這些疫霉菌特有的小蛋白能夠激發(fā)模式植物煙草的防衛(wèi)反應(yīng)，并誘導(dǎo)產(chǎn)生對細菌、真菌和病毒的抗性，因此被稱作 Elicitins［26］。

另外，大豆疫霉的細胞壁成分β-1，3-葡聚糖也可以成功觸發(fā)大豆的防衛(wèi)反應(yīng)［25，27］。當(dāng)休止孢萌發(fā)或遭遇到大豆外泌葡聚糖酶的時候，大豆疫霉細胞壁降解產(chǎn)生的碎片也會激發(fā)植物PTI［28］。研究發(fā)現(xiàn)大豆疫霉細胞壁上的一個糖蛋白C端13個氨基酸（VWNQPVRGFKVYE，PEP-13）的短肽段即可成功觸發(fā)植物PTI［29］。疫霉菌細胞壁上的另一個糖蛋白（Cellulose-binding elicitor lectin，CBEL）也可以觸發(fā)煙草的PTI，并誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)獲得抗性［30］。

除了這些來源于病原微生物本身的PAMPs，當(dāng)病原微生物侵染植物時，破壞或降解植物組織而產(chǎn)生的一些代謝成分也能夠被植物識別，觸發(fā)植物的免疫反應(yīng)［31］。對于可以主動侵入寄主的真菌及卵菌來說，在侵染過程中會釋放大量的細胞壁降解酶，來破壞寄主的細胞壁。一方面，這些酶類降解植物細胞壁產(chǎn)生的碎片或產(chǎn)物能觸發(fā)寄主免疫反應(yīng)；另一方面，這些酶蛋白本身也可作為病原相關(guān)的分子模式直接被植物識別［31-33］。例如，大豆疫霉的外泌木葡聚糖酶PsXEG1，可以強烈的觸發(fā)植物細胞死亡［34］。研究表明，大豆對PsXEG1毒性的抑制依賴于GmGIP1（Glucanase inhibitor protein 1）蛋白與其直接互作［14］。有趣的是，大豆疫霉為了逃避寄主對PsXEG1的識別，還分泌出一個與GmGIP1結(jié)合能力更強的蛋白PsXLP1（XEG1-like protein 1）來作為誘餌（Decoy），保護 PsXEG1 的毒性作用［14，35］。雖然PsXLP1與PsXEG1在序列上高度同源，但從植物免疫系統(tǒng)的角度出發(fā)，可以將PsXEG1定義為大豆疫霉的PAMP，而將PsXLP1劃分到胞外效應(yīng)分子范疇。2.2.2 大豆識別大豆疫霉的效應(yīng)分子觸發(fā)ETI 大豆疫霉基因組中有大量具有豐富多樣性的毒性相關(guān)基因家族［6，36］。這些基因家族編碼了蛋白水解酶、水解酶抑制蛋白、毒素蛋白等胞外效應(yīng)分子以及兩類龐大的胞內(nèi)RXLR和Crinklers（CRN）效應(yīng)分子家族［6，36-37］。

無論是在植物胞內(nèi)還是胞外起作用的效應(yīng)分子，都是具有功能模塊的分泌蛋白，蛋白N端具有信號肽，而C端則是毒性功能域［37］。而胞內(nèi)效應(yīng)分子一般還具有一個寄主錨定序列，負責(zé)將效應(yīng)分子轉(zhuǎn)運到植物細胞內(nèi)。例如，RXLR效應(yīng)分子家族就是以其寄主錨定序列精氨酸R-X-亮氨酸L-精氨酸R（X代表任意氨基酸）來命名的，這類效應(yīng)分子家族的成員則多達 350 個［2，37］。

目前克隆的大豆疫霉無毒基因均屬于RXLR效應(yīng)分子家族［36，38-47］，說明大豆抗病蛋白是在胞內(nèi)對這些無毒蛋白產(chǎn)生識別的。然而有趣的是，盡管研究者通過酵母雙雜交、Co-IP等技術(shù)在持續(xù)尋找這些無毒蛋白的互作蛋白，卻沒能篩選到與之直接互作的抗病R蛋白。甚至已經(jīng)被克隆的抗病蛋白Rps1k也已經(jīng)驗證不能直接和無毒蛋白Avr1k互作［39］。這說明大豆對大豆疫霉RXLR效應(yīng)分子的識別機制非常復(fù)雜，并非簡單的通過直接互作來實現(xiàn)。

研究還發(fā)現(xiàn)，一些RXLR效應(yīng)分子如Avh18、Avh25、Avh105、Avh147、Avh238和 Avh241等 都能被植物識別并引起大豆細胞的過敏性死亡［13］。

Crinklers因其能引起煙草細胞皺縮壞死（Crinkle）而被命名，其蛋白也具有保守的寄主錨定序列LXLFLAK，預(yù)測其具有將CRN效應(yīng)分子轉(zhuǎn)運至植物細胞的功能。大豆疫霉中有200多個CRN效應(yīng)分子，一些Crinkler能夠被植物識別導(dǎo)致細胞死亡，如 PsCRN63［48］。

3 大豆疫霉逃避寄主識別的分子策略

3.1 大豆疫霉抑制寄主的PTI反應(yīng)

由于PAMP分子的保守特性，疫霉菌和其它病原菌都采用泌出效應(yīng)分子來干擾或者破壞植物的PTI反應(yīng)，達到成功侵染的目的［12］。研究表明，在大豆疫霉侵染前期上調(diào)表達的一系列效應(yīng)分子具有抑制寄主PTI的功能［13，34］。例如，大豆疫霉RXLR效應(yīng)分子Avh238，在侵染前12 h內(nèi)上調(diào)了約120倍。研究發(fā)現(xiàn)Avh238能夠抑制疫霉菌Elicitin（INF1）在煙草細胞中觸發(fā)的超敏反應(yīng)（Hypersensitive response，HR），同時對PTI信號通路上的關(guān)鍵激酶NPK1和MKK1觸發(fā)的HR反應(yīng)具有抑制作用［13］。而大豆疫霉PsXEG1作為一類保守的PAMP分子，其引發(fā)的植物免疫反應(yīng)也能夠被多個RXLR效應(yīng)分子所抑制，如Avh52、Avh62、Avh94和Avh109等都能夠抑制PsXEG1觸發(fā)的活性氧迸發(fā)、HR反應(yīng)以及PTI相關(guān)基因的表達［34］。

3.2 大豆疫霉無毒基因的反識別機制

目前克隆的大豆疫霉無毒基因都屬于RXLR效應(yīng)分子家族，包括Avr1a、Avr1b、Avr1c、Avr1d、Avr1k、Avr3a/5、Avr3b、Avr3c 和 Avr4/6［36，38-47］。 目前識別這些無毒基因并觸發(fā)免疫反應(yīng)的抗病基因在田間已經(jīng)陸續(xù)被“攻克”。因此，了解無毒基因逃避寄主識別的分子機制，是了解品種抗性喪失、針對性開發(fā)新抗病資源的急切需求。

Avr1b是第一個被克隆的疫霉菌無毒基因，在無毒菌株P(guān)7064中有著高量的mRNA積累，而在毒性菌株P(guān)7373和P7074中則因為啟動子區(qū)插入了一個3 kb的片段而喪失了mRNA的積累，在毒性菌株P(guān)6497中則完全沉默［49］。類似基因沉默的策略在無毒基因Avr1a、Avr1c、Avr3a/5和Avr4/6中也存在［40，46-47，50］。Avr1b 在毒性菌株中還存在著多種序列多態(tài)性，如毒性菌株P(guān)7076的C末端存在著21個氨基酸的變異，如此劇烈的序列突變也使Avr1bP7076成功逃避了抗病蛋白的識別［51］。類似采用序列變異來逃避識別的還有無毒基因Avr3a/5、Avr3b和Avr3c［42-43，45］。對于無毒基因 Avr1d 來說，盡管其蛋白C末端也存在著劇烈的變異，但是沒有對抗病蛋白Rps1d的識別造成影響［41］。通過對無毒菌株和有毒菌株的基因組進行比較發(fā)現(xiàn)，在毒性菌株中缺失了Avr1d的序列，而采取類似的基因剔除策略的無毒基因還有 Avr1a 和 Avr1c［40-41，47］。有的無毒基因如Avr3b和Avr1k則因為序列的插入和變異造成移碼突變而使蛋白的翻譯提前終止，卻恰好逃避了無毒蛋白對其的識別［39，43-44］。

大豆疫霉無毒基因的這種遺傳多樣性，也反映出大豆抗病品種對其施加的選擇壓力。由于大豆疫霉進化速度快，某些突變造成的無毒性喪失會迅速形成新的優(yōu)勢小種，使得品種中由Rps基因控制的質(zhì)量抗性失效變得感病，造成嚴重的損失。

3.3 大豆疫霉效應(yīng)分子協(xié)同互作抑制ETI

對大豆疫霉4個菌株的基因組及轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)現(xiàn)，RXLR效應(yīng)分子的轉(zhuǎn)錄模式可以分為誘導(dǎo)表達和持續(xù)轉(zhuǎn)錄兩種模型，并面臨著不同的進化選擇壓力［13］。對于誘導(dǎo)表達的效應(yīng)分子來說，因為表達量較高通常會面臨巨大的選擇壓力。如大豆疫霉的RXLR效應(yīng)分子Avh238，在侵染前期劇烈上調(diào)表達，大豆、煙草和一些茄科作物都能夠識別Avh238并產(chǎn)生ETI［52］。然而在大豆疫霉中還存在多個效應(yīng)分子能夠抑制Avh238被植物識別所產(chǎn)生的ETI反應(yīng)［13］。這些抑制ETI的效應(yīng)分子不僅包括了一些低表達量的RXLR效應(yīng)分子，還包括了一些CRN效應(yīng)分子［48］。

對于無毒基因和抗病基因互作所觸發(fā)的過敏性壞死反應(yīng)，也能夠被一些效應(yīng)分子所抑制，如Avh172、Avh6都能夠抑制致病疫霉無毒蛋白Avr3a和馬鈴薯抗病蛋白R3a之間的互作［13］。而Avr1d也能夠抑制Avr1b和Rps1b之間的互作［41］。說明在大豆疫霉和大豆的協(xié)同進化過程中，大豆疫霉不斷產(chǎn)生新的效應(yīng)分子來抑制寄主的防衛(wèi)反應(yīng)，而對于大豆來說，由于自身進化和育種周期的限制，往往無法及時應(yīng)對大豆疫霉進化產(chǎn)生的優(yōu)勢生理小種。

4 總結(jié)與展望

大豆疫霉造成的大豆疫病已經(jīng)嚴重威脅到大豆產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。在我國主要大豆產(chǎn)區(qū)，大豆疫病也呈現(xiàn)逐漸加重的趨勢。在農(nóng)業(yè)面源污染嚴重、倡導(dǎo)綠色農(nóng)業(yè)的大環(huán)境下，推廣使用抗病品種控制大豆疫病是減施農(nóng)藥、實現(xiàn)農(nóng)藥零增長的迫切要求。然而大豆疫霉在田間變異迅速，已經(jīng)陸續(xù)攻克了所有目前已知的抗病基因。因此針對性的挖掘新型的抗病基因，拓寬抗病育種資源，通過傳統(tǒng)育種技術(shù)與分子育種技術(shù)結(jié)合實現(xiàn)精準育種將是未來大豆抗病育種的發(fā)展方向。

從目前大豆疫霉和大豆的互作研究發(fā)現(xiàn)，寄主主要是通過識別保守的PAMP或者RXLR效應(yīng)分子開啟免疫防衛(wèi)反應(yīng)。因此，這兩類大豆疫霉特有的病原分子是開發(fā)大豆新型抗病育種靶標的主要研究對象。

PAMP是非常保守、不易通過進化而除去的一類病原分子。目前研究者也在著力挖掘新的大豆疫霉PAMP，針對性地設(shè)計病害防控策略［11，34］。如大豆疫霉的木葡聚糖酶PsXEG1就是一類新發(fā)現(xiàn)的PAMP［34］。研究發(fā)現(xiàn)這一類木葡聚糖酶家族蛋白在多種大豆根部病原菌如鐮刀菌中都有保守序列存在，如果能找到植物中識別XEG1并誘導(dǎo)植物抗病性的免疫組件，并通過基因編輯使之更加特異地與大豆疫霉和鐮刀菌的XEG1蛋白結(jié)合，則會極大地增強大豆抗根部病害能力，有助于構(gòu)建持久抗病性作物。

而對于進化較快的胞內(nèi)效應(yīng)分子，研究者也在基于其進化和毒性的機制而開發(fā)新的抗病靶標［53］。對于數(shù)量眾多的RXLR效應(yīng)分子來說，既然能夠主動通過基因沉默或刪除突變來逃避寄主的識別，說明其功能在一定程度上是冗余的［54］。而對于一些具有時空表達特性和重要功能的效應(yīng)分子如Avh238、Avh172來說，又是病原菌在侵染過程中不可或缺的一部分［13］。因此，為了避免效應(yīng)分子的快速進化而造成的抗性丟失，在選擇RXLR效應(yīng)分子作為靶標篩選抗源的時候要遵循3個基本原則：病原菌毒力所必需、在不同菌株中保守存在以及面臨較低的選擇壓力。結(jié)合目前的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，可以將篩選的范圍縮小至幾十個甚至十幾個RXLR效應(yīng)分子的規(guī)模。然后再對這些效應(yīng)分子進行基因沉默或者敲除等遺傳操作，對轉(zhuǎn)化子的毒力進行評估，即可篩選到合適的抗源靶標。根據(jù)俄勒岡州立大學(xué)基因組研究及生物計算中心的報道，有3個效應(yīng)分子Avh16、Avh180和Avh240基本符合這個篩選規(guī)則。而在栽培大豆和野生大豆的多個株系中也獲得了相應(yīng)的抗源（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。這些新穎的抗源材料，將有助于新一代抗病品種的育種開發(fā)和推廣。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，農(nóng)作物育種也正在從傳統(tǒng)育種走向精確育種。針對病原菌的侵染特點，精準設(shè)計抗病策略，精確設(shè)計育種靶標，通過分子育種實現(xiàn)各類優(yōu)良基因的聚合，培育“理想品種”，將是未來農(nóng)作物育種的發(fā)展方向。

長期以來對大豆抗性的研究一直集中在抗病基因的鑒定上，育種和生產(chǎn)上也一直通過Rps基因介導(dǎo)的質(zhì)量抗性對大豆疫病進行防治［55］。然而大豆疫霉種群在抗性品種的選擇壓力下會迅速變異，毒力結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)越來越復(fù)雜的趨勢，導(dǎo)致單基因控制的質(zhì)量抗性喪失效果。為構(gòu)筑大豆對疫霉菌的持久抗病性，在深入了解大豆疫霉逃避寄主免疫機制的前提下，統(tǒng)籌聚合新挖掘的單基因抗性和優(yōu)質(zhì)數(shù)量抗性資源，最終通過精準育種才能獲得廣譜抗病的理想大豆品種。

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