何婷婷，王卉，田嘉禾，張錦明*

1.解放軍總醫(yī)院海南分院核醫(yī)學(xué)科，海南三亞 572013；2.解放軍總醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，北京 100853； *通訊作者 張錦明zhangjm301@163.com

原發(fā)肝癌的早期診斷、治療和治療后的及時隨訪對提高患者的生存率有非常重要的意義。近年來PET/CT顯像在肝癌診斷中得到廣泛應(yīng)用，其中廣譜類的腫瘤顯像劑主要是18氟-氟代脫氧葡萄糖（18F-fluoro-2-deoxyglucose，18F-FDG），其腫瘤攝取和治療后預(yù)后相關(guān)[1]。然而PET顯像費用昂貴不易普及。而相對廉價的單光子發(fā)射計算機斷層成像術(shù)（single-photon emission computed tomography，SPECT）在肝癌診斷上尚無理想的腫瘤顯像劑。趨化因子受體-4（C-X-C chemokine receptor type 4，CXCR4）是G蛋白偶聯(lián)受體蛋白家族的一員，與基質(zhì)細胞衍生因子（stromal cell-derived factor 1，SDF-1），也稱C-X-C motif chemokine 12（CXCL12）相互作用后啟動下游信號通路形成 SDF-1/CXCL12/CXCR4生物軸，在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[2]。本文擬通過99Tcm標(biāo)記的CXCR4特異性拮抗劑AMD3100，對2株肝癌細胞HepG2和QGY7701的攝取特征進行初步研究，并與18F-FDG進行比較，以探討99Tcm-AMD3100 SPECT顯像能否在體評估肝癌細胞CXCR4的表達，并幫助判別肝癌細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力。

1 材料與方法

1.199Tcm-AMD3100與18F-FDG的制備與質(zhì)量控制AMD3100由Sigma公司提供，采用配體轉(zhuǎn)移法，先制備99Tcm-GH（MDP）等中間轉(zhuǎn)移配體，再由AMD3100與之競爭以制備最終產(chǎn)品。標(biāo)記完畢后將示蹤劑的比活度稀釋調(diào)整為3.7~7.4 MBq/0.5 ml備用。放化純>90%方可使用。18F-FDG由解放軍總醫(yī)院放射性藥物合成中心提供，依照說明書制備和質(zhì)量控制。制成比活度為 3.7~7.4 MBq/0.5 ml（37 GBq/L）的18F-FDG溶液備用。

1.2 細胞培養(yǎng) 人類肝癌細胞株HepG2與QGY7701（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海細胞庫）在含10%的優(yōu)級胎牛血清、100 kU/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中（PAA公司），于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。硝酸纖維素膜購自普利來基因技術(shù)有限公司；RT-PCR試劑盒購自Promega公司；AMD3100購自Sigma公司。

1.3 細胞侵襲及遷移實驗 將Matrigel放在冰上然后放入冰箱中隔夜使其解凍，與無血清DMEM按1∶1混合，取24孔板，每孔加入40 μl，置37℃使其凝聚成膠狀。遷移實驗中濾膜無需鋪膠，余步驟與Matrigel侵襲實驗相同。在24孔板中加入含10%小牛血清的細胞培養(yǎng)液，將細胞懸液加入Transwell小室中，每小室200 μl，每種細胞重復(fù)3孔，將小室浸于24孔板的完全培養(yǎng)液中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h，取出小室，去掉上層小室中的培養(yǎng)液，并用棉棒仔細去除上層小室側(cè)的未遷移細胞和Matrigel。小室外側(cè)細胞用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，用PBS清洗3遍。鏡下觀察遷移杯底面細胞。在顯微鏡下拍照。用33%醋酸脫色，將結(jié)晶紫完全洗脫下來，洗脫液可在酶標(biāo)儀上562 nm測其OD值，間接反映細胞數(shù)。

1.4 肝癌細胞CXCR4mRNA水平檢測 根據(jù)GenBank中CXCR4 cDNA的序列設(shè)計引物，上游引物：5’-GAACTTCCTATGCAAGGCAGTCC-3’，下游引物：5’-CCATGATGTGCTGAAACTGGAAC-3’，產(chǎn)物大小為302 bp。內(nèi)參照GAPDH：上游引物：5’-CTGCACCACCAACTGCTTAG-3’，下游引物：5’-CCACTGACACGTTGGCAGTG-3’，產(chǎn)物大小為275 bp。取對數(shù)生長期肝癌細胞，采用Trizol法提取細胞的總RNA，用RNase-freeDNase I處理后進行RT-PCR。PCR反應(yīng)體系：模板1 μl；上游引物1 μl；下游引物1 μl；2×Tag PCR MasterMix 12.5 μl；H2O 9.5 μl；總體積25 μl。PCR擴增條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用凝膠圖像掃描儀拍照并用Image J軟件進行條帶灰度分析，以CXCR4/GAPDH的比值代表其相對表達量，每個條帶測量3次。

1.5 體外肝腫瘤細胞99Tcm-AMD3100攝取實驗 ①將2株肝癌細胞分別接種于6孔板，待細胞生長至80%左右，實驗前更換新鮮培養(yǎng)基。取示蹤劑用PBS液稀釋，PBS液用量根據(jù)計數(shù)進行調(diào)整，取稀釋后示蹤劑液30~100 μl加入空白小試管中，置入井型γ-計數(shù)儀中計數(shù)，使計數(shù)穩(wěn)定在100 000以下。分別孵育30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min，每組均設(shè)3個復(fù)孔。②每組孵育結(jié)束時，培養(yǎng)孔用PBS洗滌細胞3次，0.25%胰酶消化2 min，用1.5 ml含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液終止消化。③收集全部細胞懸液放入小管中，γ-計數(shù)器測定每個小管中細胞的放射性計數(shù)并記錄，計算每1×106個細胞的放射性活度，并進行細胞計數(shù)。④數(shù)據(jù)校正計算公式。細胞攝取率計算：%ID/106=實驗計數(shù)/空白管計數(shù)×100%/細胞計數(shù)（單個細胞的示蹤劑攝取量與加入示蹤劑總量的比值）。方法同上計算2株細胞對18F-FDG的攝取。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 10.0軟件，計量資料均以±s表示，比較采用方差分析或t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2株肝癌細胞體外遷移及侵襲能力比較 遷移實驗中見較多HepG2細胞和QGY7701細胞穿越濾膜，鏡下顯示HepG2穿越細胞數(shù)多于QGY7701，HepG2的 OD 值（1.243±0.100）高于 QGY7701（1.170±0.155），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；侵襲實驗中見部分細胞穿越基質(zhì)膠和濾膜，HepG2的 OD值（0.433±0.025）高于 QGY7701（0.347±0.032），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 肝癌細胞 CXCR4mRNA 水平檢測 HepG2、QGY7701肝癌細胞系均存在CXCR4mRNA水平的表達（圖1），相對表達量分別為 0.888±0.048、0.786±0.027，HepG2細胞CXCR4mRNA表達明顯高于QGY7701，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

圖1 HepG2和QGY7701細胞的CXCR4mRNA表達水平，*P<0.05

2.3 2株肝癌細胞99Tcm-AMD3100和18F-FDG攝取率比較 2株肝癌細胞對于99Tcm-AMD3100及18F-FDG的攝取率見表1、2，99Tcm-AMD3100在2株肝癌細胞中攝取率呈波動式上升。18F-FDG的攝取率均隨時間的延長而持續(xù)增加。2株肝癌細胞在15 min、30 min、60 min及360 min時，HepG2的99Tcm-AMD3100攝取率高于QGY7701，其中60 min攝取率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而在120 min及180 min時，QGY7701的99Tcm-AMD3100攝取率高于 HepG2，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。在 30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min 6個時間點，HepG2的18F-FDG攝取率均高于QGY7701，其中30 min、120 min及150 min時2株細胞18F-FDG的攝取率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）。2株細胞對18F-FDG攝取較快，攝取率更高，而99Tcm-AMD3100的攝取率偏低，且2株細胞間變化較小。同一株細胞在不同時間點18F-FDG的攝取率均高于99Tcm-AMD3100，其中120 min和180 min時，HepG2細胞中18F-FDG 的攝取率明顯高于99Tcm-AMD3100，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05），而在30 min和120 min時，QGY7701細胞中18F-FDG的攝取率明顯高于99Tcm-AMD3100，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05），見圖2。

3 討論

表1 2株肝癌細胞不同時間點99Tcm-AMD3100攝取率的比較（n=3）

表2 2株肝癌細胞不同時間點18F-FDG攝取率的比較（n=5）

圖2 18F-FDG及99Tcm-AMD3100在HepG2或QGY7701細胞中攝取率的比較，*P<0.05

趨化因子主要參與調(diào)節(jié)感染、炎癥以及組織修復(fù)相關(guān)的免疫反應(yīng)，并且在胚胎形成階段調(diào)控多種細胞的遷移。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)46種趨化因子和18種趨化因子受體[3]。其中 CXCR4屬于特異性趨化因子受體，在多種不同類型腫瘤中均有表達，在侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[2,4-5]。有研究表明，CXCR4高表達的腫瘤病情進展快且預(yù)后不良，在 CXCL12/CXCR4表達與患者預(yù)后相關(guān)的腫瘤研究中，高表達CXCL12的組織形成的遠處轉(zhuǎn)移灶是此類腫瘤患者的主要死亡原因[6-7]。而AMD3100作為強效、選擇性非肽類趨化因子CXCR4受體拮抗劑，能與SDF-1競爭結(jié)合CXCR4，能抑制大多數(shù)惡性腫瘤，對腫瘤起治療作用。研究表明，金屬離子Cu2+、Zn2+等與AMD3100絡(luò)合后其與CXCR4的親和性提高了數(shù)十倍，這為AMD3100用于廣譜類惡性腫瘤顯像提供了可能[8]；但64Cu本身會分解聚集于肝臟內(nèi)造成肝臟本底攝取增高。因此本研究選擇99Tcm-AMD3100作為CXCR4受體顯像劑。該示蹤劑具備高靶本比的同時，肝臟攝取明顯減低，適用于腫瘤CXCR4受體的活體化研究[9]。既往CXCR4受體探針的研究主要集中在藥代動力學(xué)、藥物體外生物學(xué)分布及毒性試驗方面[8-9]。經(jīng)研究證實，CXCR4高表達的腫瘤細胞及動物模型能特異性攝取CXCR4探針；還有部分研究將該類探針用于某些腫瘤（如小細胞肺癌、腦膠質(zhì)母細胞瘤）活體顯像，發(fā)現(xiàn)CXCR4高表達的活體腫瘤組織均存在不同程度CXCR4探針的攝取，且與腫瘤組織 CXCR4表達高低有一定相關(guān)性，但部分CXCR4高表達的腫瘤無顯著放射性濃聚，考慮可能與該受體的動力學(xué)特征及內(nèi)化有關(guān)[10-11]；且該類臨床研究例數(shù)有限，同時CXCR4受體探針濃聚程度受多種因素影響，如治療方案及化療藥物等。

本研究在制備99Tcm-AMD3100的基礎(chǔ)上，選取了組織來源不同的2株肝癌細胞，通過RT-PCT法檢測CXCR4mRNA的差異性表達，判斷細胞體外遷移及侵襲能力大小，同時利用99Tcm-AMD3100進行細胞核素攝取實驗，并與經(jīng)典腫瘤顯像劑18F-FDG進行對比，研究其CXCR4的表達與細胞遷移、侵襲能力及攝取率之間的關(guān)系。實驗證明，所選2種肝癌細胞均不同程度地表達CXCR4，其mRNA表達水平與2株肝癌細胞侵襲能力呈正相關(guān)趨勢，王勃等[12]在研究中同樣發(fā)現(xiàn)CXCR4高表達的肝癌細胞其轉(zhuǎn)移潛能高于低轉(zhuǎn)移潛能肝癌細胞，提示CXCR4可能是肝癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵因子。同時本實驗中CXCR4高表達的HepG2細胞，其99Tcm-AMD3100和18F-FDG攝取率明顯高于QGY7701，提示肝癌細胞中CXCR4mRNA表達與CXCR4受體探針、18F-FDG攝取值呈正相關(guān)趨勢，與既往文獻報道[13]基本一致，但同一株細胞內(nèi)99Tcm-AMD3100的攝取率明顯低于18F-FDG。Vag等[13]在研究中也發(fā)現(xiàn)同一腫瘤組織中68Ga-pentixafor（CXCR4受體探針）攝取值偏低，考慮是由于該探針結(jié)合位點在細胞質(zhì)，而通過轉(zhuǎn)錄或蛋白水平 CXCR4的表達則位于細胞表面造成，認為CXCR4受體探針可能更適用于某些特殊類型腫瘤顯像（如多發(fā)性骨髓瘤）。盡管HepG2細胞的CXCR4mRNA表達明顯高于 QGY7701，但在不同時間點 2株肝癌細胞99Tcm-AMD3100攝取率高低略有不同，提示2株肝癌細胞99Tcm-AMD3100體外攝取動力學(xué)特點與18F-FDG略有不同，而HepG2不同時間點的99Tcm-AMD3100平均攝取率高于QGY7701，與2株肝癌細胞CXCR4mRNA表達呈正相關(guān)趨勢，同時侵襲力高的 HepG2細胞的99Tcm-AMD3100和18F-FDG攝取率均高于侵襲力低的QGY7701細胞，提示99Tcm-AMD3100和18F-FDG攝取率均可作為判定細胞侵襲力高低的指標(biāo)之一。

本研究通過不同生物學(xué)特性肝癌細胞初步觀察了99Tcm-AMD3100的體外攝取動力學(xué)特征，并與18F-FDG進行比較，盡管99Tcm-AMD3100體外攝取率低于18F-FDG，且隨時間變化差異較大，但2株肝癌細胞99Tcm-AMD3100攝取率與CXCR4表達及侵襲能力呈正相關(guān)趨勢，提示99Tcm-AMD3100可作為一種特異性強的新型腫瘤顯像劑用于肝癌研究，但本文僅從細胞水平初步評估CXCR4受體表達與相關(guān)探針的相互關(guān)系，還需通過動物模型及活體顯像進一步驗證兩者之間的相關(guān)性。

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