雷琳，闞茗銘，葉發(fā)銀，趙國華,2*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715) 2(重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶，400175)

硫代葡萄糖苷，簡稱硫苷(glucosinolates)，是一類含硫、含氮、陰離子、親水性的植物次生代謝產(chǎn)物，由β-硫代葡萄糖基和1個與硫原子連接的側鏈R組成。根據(jù)側鏈R不同，可將硫苷分為三大類型：即脂肪族、吲哚族和芳香族硫苷[1]。硫苷廣泛存在于十字花科蕓薹屬蔬菜中，在植物體中完整的硫苷并不具有生理活性，但當植物被咀嚼或機械破碎時，硫苷在內(nèi)源黑芥子酶的作用下容易水解生成異硫氰酸酯、硫氰酸酯、惡唑烷酮和腈類等具有生物活性的化合物[2]。

近年來，吲哚族硫苷降解產(chǎn)物由于其特殊的生理功能越來越受到關注。AGERBIRK等[3]的研究表明(圖1),當蕓薹屬蔬菜組織被破壞后，黑芥子酶水解3-吲哚基甲基硫苷生成吲哚-3-乙腈(indole-3-acetonitrile，I3A)和吲哚-3-甲基異硫氰酸鹽，后者不穩(wěn)定，接著與水、抗壞血酸、氨基酸及其他植物代謝物生成抗壞血酸原(ascorbigen，ABG)[4]和吲哚-3-甲醇 (indole-3-carbinol，I3C)等具有生理活性的物質(zhì)。在加熱、弱酸性及中性溶液中，I3C發(fā)生縮合形成二聚物3,3-二吲哚基甲烷及其他三聚物[5]。研究表明I3C具有減緩葡萄球菌腸毒素B介導的肝損傷[6]、防止順鉑誘導的急性腎毒性[7]、抗腫瘤[8]及抑制微生物生長[9]等活性。

a, 3-吲哚基甲基硫苷；b，吲哚-3-乙腈；c，吲哚-3-甲基異硫氰酸鹽；d，吲哚-3-甲醇；e，抗壞血酸原;f，3,3-二吲哚基甲烷；AA，抗壞血酸圖1 3-甲基吲哚基硫苷降解的簡化途徑Fig.1 Simplified summary of breakdown of indol-3- ylmelthylglucosinolate

機械、冷凍和熱加工會顯著影響植物硫苷和異硫氰酸鹽的種類及含量[10-11]。蔬菜被食用前通常需要經(jīng)過工業(yè)或烹飪加工，其中熱燙是必要的預熟處理工藝之一[12]。然而，有關熱燙對蔬菜硫苷及其吲哚族硫苷主要降解產(chǎn)物的影響鮮見報道。本文選用國內(nèi)4種常見的蕓薹屬蔬菜——甘藍、娃娃菜、小白菜、瓢兒菜，研究90 ℃下不同熱燙時間對硫苷及其吲哚族硫苷主要降解產(chǎn)物(I3C、I3A和ABG)的影響，初步掌握有利于發(fā)揮此類蔬菜生理功能的加工方式。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘藍(BrassicaoleraceaL.)、娃娃菜(Brassicarapapekinensissp.)、小白菜(BrassicacampestrisL. subsp.chinensisvar.communis(L.) Makino, Tsen et Lee )和瓢兒菜(Brassicarapachinensis)均購自農(nóng)貿(mào)市場。將蔬菜清理干凈，通風瀝干后，分割成大小均勻的塊狀(3 cm×3 cm)，各取4份，每份200 g，置于保鮮袋中，放入-80 ℃冰箱備用。

苯甲基硫苷標準品(glucotropaeolin, TRO) (>95%)，日本TCI公司；硫酸酯酶(≥10,000 units/g solid), 美國Sigma公司；DEAE SephadexA-25，美國Amersham Biosciences公司；I3C (≥98%)、I3A (≥98%)、四甲基氯化銨，中國Adamas-beta公司。參照EWA等[13]的方法，用I3C和抗壞血酸合成ABG。其他試劑均為分析純，購自成都科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

BS-223S電子天平，德國塞多利斯公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市富華儀器有限公司; LC-20A高效液相色譜儀(紫外/熒光檢測器)，日本島津公司；5810型臺式高速離心機，德國Eppendorf公司；DHG-9140恒溫鼓風干燥箱，上海齊欣科學儀器有限公司；ALPHA1-4 LSC真空冷凍干燥機，河南兄弟儀器設備有限公司；DZF-6020真空干燥箱，上海齊欣科學儀器有限公司；PB-10電化學分析儀/pH計，德國賽多利斯公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 蔬菜的熱燙處理

在1 000 mL 大燒杯中加入500 mL超純水，于恒溫水浴鍋內(nèi)加熱至90 ℃。將200 g蔬菜樣品倒入90 ℃超純水中。4份樣品分別在90 ℃超純水中熱燙處理0、20、40、60 s。處理后的樣品瀝去表面水分， 立即放在-20 ℃冰箱中預冷卻24 h，經(jīng)真空冷凍干燥48 h后，粉碎，過200目篩，置-80 ℃ 冰箱中，備用。

1.3.2 硫苷的提取與分析

參照VAN等[14]的方法并作適當修改。稱取熱燙處理后的凍干蔬菜樣品5 g，置于15 mL離心管中，加入5 mL煮沸的甲醇，83 ℃水浴20 min，于3 000 r/min離心10 min，收集上清液，沉淀物再用5 mL甲醇(體積分數(shù)為70%) 重復提取2次，合并上清液。取2 mL提取液流經(jīng)DEAE SephadexA-25離子交換柱，排干提取液后，用2 mL醋酸鈉溶液(0.02 mol/L)沖洗柱子，加入75 μL硫酸酯酶溶液，室溫封口過夜后用0.5 mL超純水洗脫3次，過0.45 μm濾膜，高效液相色譜(high-performance liquid chromatography, HPLC)分析硫苷含量。

HPLC分析條件[15]：色譜柱為Thermo BDS C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，流動相A：四甲基氯化銨(0.5 g/L)，流動相B：乙腈(體積分數(shù)為20%)；線性梯度洗脫程序為1 min時，100% A；21 min時，100% B；26 min時，100% A，保持5 min后結束；31min內(nèi)可使硫苷全部分離；檢測波長229 nm；流速1.1 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量10 μL；以TRO作為內(nèi)標。按照公式1，根據(jù)保留時間、峰面積、內(nèi)標和相對校正系數(shù)對硫苷組分進行定量測定[15-16]。

(1)

式中：D,干基樣品中硫苷含量，μmol/g干重；Ag,脫硫硫苷峰面積；Ab,內(nèi)標峰面積；n,試樣中加入內(nèi)標的量，μmol；m,稱量試樣質(zhì)量，g；Kg，脫硫硫苷相對校正系數(shù)(見表1)。

表1 脫硫硫苷相對校正系數(shù)[15]Table 1 Correction of coefficient of desulfo-glucosinolates[15]

1.3.3 吲哚族硫苷降解產(chǎn)物含量測定

參照ALEKSANDROVA等[17]的方法并作適當修改。稱取熱燙處理后的凍干蔬菜樣品5 g，用10 mL丙酮提取2次，合并提取液并過濾，濾液用20 mL乙酸乙酯提取，合并有機層并用無水Na2SO4干燥，過濾膜后通過旋轉蒸發(fā)儀濃縮，殘渣用乙腈溶解至2 mL，采用外標法，HPLC定量分析各組分含量。

HPLC分析條件[13]：ODS-23 (4.6 mm×150 mm，5 μm)，流動相A：乙腈(體積分數(shù)為10%)-乙酸銨緩沖溶液(0.1 mol/L，pH=5.7)，流動相B：乙腈(體積分數(shù)為80%)-乙酸銨緩沖溶液(0.1mol/L，pH=5.7)；線性梯度洗脫程序為0 min時，100% A；25 min時，100% B并維持5 min；35 min時，100% A，保持5 min后結束；40 min內(nèi)可使吲哚族硫苷降解產(chǎn)物全部分離；檢測波長280 nm；流速1.3 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量20 μL；以I3A、I3C和ABG作為外標，繪制標準曲線，分別得到線性回歸方程進行定量測定，以μmol/g干重為單位。I3A回歸方程為：y=36 756x+12 054，R2=0.992 8；I3C回歸方程為：y=52 494x-1 716.1，R2=0.999 4；ABG回歸方程為：y=5 100.7x+3 613.6，R2=0.998 3。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗進行3次重復測定，測定結果以平均值±標準差表示，顯著性差異用多重比較法中的標記字母法表示，用SPSS19.0.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，顯著性水平為p<0.05。

2 結果與分析

2.1 四種新鮮蕓薹屬蔬菜硫苷組成

由表2可知，4種蔬菜中檢測出9種硫苷，包括4種脂肪族硫苷、4種吲哚族硫苷、1種芳香族硫苷，且脂肪族硫苷總量>吲哚族硫苷總量>芳香族硫苷總量。不同蕓薹屬蔬菜總硫苷含量差異較大，甘藍總硫苷含量最高，其次是娃娃菜、小白菜、瓢兒菜。這與何洪巨等[18]的研究一致，即白菜類(娃娃菜、小白菜、瓢兒菜)的硫苷含量低于甘藍類。

本研究中鮮甘藍含量較高的是4-戊烯基硫苷(glucobrassicanapin，GBN)、2-羥基-3-丁烯基硫苷(progoitrin，PRO)和4-甲氧基-3-吲哚甲基硫苷(4-methoxyglucobrassicin，4ME)，含量最低的是4-羥基-3-吲哚甲基硫苷(4-hydroxyglucobrassicin，4OH)、3-吲哚甲基硫苷(glucobrassicin，GBC)和1-甲氧基-3-吲哚甲基硫苷(neoglucobrassicin，NEO)；弓志青等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，PRO、丙烯基硫苷(sinigrin，SIN)和GBC為甘藍中的主要硫苷；而PRO是致甲狀腺腫素的前體物質(zhì)，SIN是蕓薹屬蔬菜主要的辛辣味物質(zhì)。這些差異可能是由于甘藍的品種、采摘階段、栽培條件的不同所致。鮮娃娃菜中未檢測到PRO及苯乙基硫苷(phenylethylglu-cosinolate，GNT)，其含量最豐富的是3-丁烯基硫苷(gluconapin，NAP)，約為4OH的19倍。小白菜和瓢兒菜中含量最豐富的是GBN；小白菜中未檢測到NEO；瓢兒菜中未檢測到4OH，4ME和NEO含量接近且最少。

表2 四種新鮮蕓薹屬蔬菜硫苷組成Table 2 The compositions of glucosinolates in fourselected Brassica vegetables

注：“-”，該樣品中未檢出此種物質(zhì)。同行小寫字母不同代表差異顯著，p<0.05。

2.2 熱燙降低蕓薹屬蔬菜硫苷含量

如圖2所示，經(jīng)熱燙后各蔬菜總硫苷含量均隨熱燙時間的延長而顯著降低。甘藍熱燙20 s后，總硫苷保留率為70%；當熱燙時間延長至60 s時，總硫苷保留率降低至27%；娃娃菜，小白菜和瓢兒菜前期受熱燙影響較大，20 s時，總硫苷保留率為45%；當熱燙時間延長至60 s時，總硫苷保留率降低至27%～29%(圖2-A)。本研究結果與其他文獻報道類似：王會霞等[20]研究燙漂對沖菜硫苷的降解變化時發(fā)現(xiàn)，硫苷的降解遵循一級降解規(guī)律，加熱時間越長，損失越多；WENNBERG等[21]發(fā)現(xiàn)與鮮樣相比，熱燙處理5 min后，甘藍總硫苷保留率顯著下降；何湘漪[22]等比較了蒸煮、微波和烹飪3種方式對十字花科蔬菜硫苷的影響，發(fā)現(xiàn)處理時間越長，蔬菜各硫苷組分的保留率越小。這說明熱燙有利于去除蕓薹屬蔬菜中PRO、SIN等不良成分。

圖2 熱燙后4種蔬菜硫苷物質(zhì)含量Fig.2 Contents of glucosinolates in four selected vegetables after blanching注：同種蔬菜不同熱燙時間下小寫字母不同表示差異顯著，p<0.05。

不同種類硫苷損失程度不同，熱燙過程中脂肪族硫苷損失率(37%～82%)>吲哚族硫苷損失率(7%～40%)>芳香族硫苷損失率(2%～14%)(圖2-B～圖2-D)。本研究及何湘漪[22]結果表明，熱加工時吲哚族硫苷的保留率大于脂肪族硫苷；相反CISKA等[23]和OERLEMANS等[24]的結果表明，與脂肪族硫苷相比，吲哚族硫苷的熱穩(wěn)定性較差，熱加工時損失較多。這可能是由于蔬菜的品種差異，導致葉片的厚度、柔軟度及蔬菜纖維含量和種類不同，從而造成不同蔬菜種類的硫苷降解情況有所變化[21, 25]。此外，小白菜在熱燙過程中，其吲哚族硫苷含量呈現(xiàn)先增加后降低的現(xiàn)象(熱燙20 s，1.67 μmol/g干重；熱燙40 s，5.26 μmol/g干重; 熱燙60 s，1.46 μmol/g干重) (圖2-C)；這可能是在熱燙初期，小白菜中一些原本與細胞壁結合的硫苷被釋放出來，而黑芥子酶在高溫下活性降低[26-27]，其水解硫苷的能力降低而使硫苷含量升高；但后期隨著熱燙時間增加，硫苷受熱降解及溶水損失影響，其含量逐漸降低。

2.3 熱燙增加蕓薹屬蔬菜吲哚族硫苷降解產(chǎn)物含量

蕓薹屬蔬菜吲哚族硫苷降解產(chǎn)物具有抗腫瘤[8]及抑制微生物生長等[9]活性，其主要降解產(chǎn)物為I3C、I3A和ABG。由表3可知，各蔬菜鮮樣總吲哚族硫苷降解產(chǎn)物含量相近，隨著熱燙時間延長，吲哚族硫苷降解產(chǎn)物含量均呈現(xiàn)不同程度增加；熱燙60 s時，吲哚族硫苷降解產(chǎn)物在娃娃菜中含量最高，約增加了5倍；在甘藍中約增加了3倍，在小白菜和瓢兒菜中約增加了1倍。4種蔬菜中ABG含量最豐富，I3C和I3A含量則相當。與鮮樣相比，甘藍I3C受熱燙影響最小，熱燙60 s后，其含量約增加了2倍；小白菜和瓢兒菜ABG受熱燙影響最小，隨熱燙時間增加，其含量均增加不到1倍；娃娃菜ABG受熱燙影響最大。

前期研究[28]發(fā)現(xiàn)十字花科蔬菜煮制15 min后，其吲哚族總硫苷降解產(chǎn)物在綠色花椰菜和紫色花椰菜中分別損失了48.5%和78.5%，但在蕪菁甘藍中增加了142.9%。CISKA等[29]發(fā)現(xiàn)白菜煮制60 min后，與鮮樣相比，其吲哚族硫苷降解產(chǎn)物I3C和I3A含量均降低了20%，而I3C的二聚縮合產(chǎn)物3,3-二吲哚基甲烷含量卻顯著增加。本研究結果與前人研究不一致，這可能是由于1)蔬菜品種差異所致；2)本研究熱燙時間較短，吲哚族硫苷降解中間產(chǎn)物來不及縮合生成二聚物和三聚物，因而在60 s內(nèi)呈現(xiàn)增加的趨勢 (圖1)[3]。

3 結論

鮮甘藍總硫苷含量在4種蕓薹屬蔬菜中最高；熱燙后各蔬菜硫苷均遭到破壞，且脂肪族硫苷損失率>吲哚族硫苷損失率>芳香族硫苷損失率。與鮮樣相比，熱燙后蔬菜中的吲哚族硫苷降解產(chǎn)物增加了約1～5倍，且熱燙60 s后娃娃菜中吲哚族硫苷降解產(chǎn)物含量最高。綜上所述，熱燙60 s可減少4種蕓薹屬蔬菜總硫苷含量，有利于去除致甲狀腺腫素前體物質(zhì)(PRO)和辛辣味物質(zhì)(SIN)；而熱燙60 s能有效增加四種蕓薹屬蔬菜吲哚族硫苷降解產(chǎn)物含量，可作為增加蔬菜抗癌等生理活性的烹飪預處理手段之一。

表3 四種蕓薹屬蔬菜吲哚族硫苷降解產(chǎn)物組成Table 3 The breakdown products of indole-glucosinolates in four selected Brassica vegetables

注：同種蔬菜同列小寫字母不同表示差異顯著，p<0.05。

[1] FRANCISCO M, VELASCO P, MORENO D A, et al. Cooking methods of Brassica rapa affect the preservation of glucosinolates, phenolics and vitamin C[J]. Food Research International, 2010, 43(5):1 455-1 463.

[2] NUGON-BAUDON L, RABOT S, WAL J M, et al. Interactions of the intestinal microflora with glucosinolates in rapeseed meal toxicity: first evidence of an intestinal Lactobacillus possessing a myrosinase-like activityinvivo[J]. Journal of the Science of Food & Agriculture, 1990, 52(4):547-559.

[3] AGERBIRK N, VOS M D, KIM J H, et al. Indole glucosinolate breakdown and its biological effects[J]. Phytochemistry Reviews, 2009, 8(1):101.

[4] TAI A, FUKUNAGA K, OHNO A, et al. Antioxidative properties of ascorbigen in using multiple antioxidant assays[J]. Bioscience Biotechnology & Biochemistry, 2014, 78(10):1 723.

[5] BUSBEE P B, NAGARKATTI M, NAGARKATTI P S. Natural indoles, indole-3-carbinol (I3C) and 3,3'-diindolylmethane (DIM), attenuate staphylococcal enterotoxin B-mediated liver injury by downregulating miR-31 expression and promoting caspase-2-mediated apoptosis[J]. Plos One, 2015, 10(2): e0118506.

[6] EINAGA R N, MAHRAN Y F. Indole-3-carbinol protects against cisplatin-induced acute nephrotoxicity: role of calcitonin gene-related peptide and insulin-like growth factor-1[J]. Scientific Reports, 2016, 6:1-13.

[7] FUJIOKA N, FRITZ V, UPADHYAYA P, et al. Research on cruciferous vegetables, indole-3-carbinol, and cancer prevention: A tribute to Lee W. Wattenberg[J]. Molecular Nutrition & Food Research, 2016, 60(6):1 228-1 238.

[8] WANG Xin-mei, HE Hong-yan, LU Yuan-zhi, et al. Indole-3-carbinol inhibits tumorigenicity of hepatocellular carcinoma cells via suppression of micro RNA-21 and upregulation of phosphatase and tensin homolog[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research, 2014, 1853(1):244-253.

[9] SOTELO T, LEMA M, SOENGAS P, et al. In vitro activity of glucosinolates and their degradation products against brassica-pathogenic bacteria and fungi[J]. Applied & Environmental Microbiology, 2015, 81(1), 432-440.

[10] 方孟瑋, 楊潤強，郭麗萍,等. 切分、汽蒸及脫水對甘藍葉片中硫苷-黑芥子酶系統(tǒng)的影響[J]. 食品科學, 2016, 37(5): 41-45.

[11] 宋亞, 李凱利, 方佳寧, 等. 鮮切紫甘藍中花青苷和硫代葡萄糖苷在貯藏過程中的變化[J]. 食品科學, 2016, 37(18): 96-101.

[12] 陳錦屏. 果品蔬菜加工學[M].西安:陜西科技出版社, 1990:79-81.

[13] EWA C, PATHAK D R. Glucosinolate derivatives in stored fermented cabbage[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004, 52： 7 938-7 943.

[14] VAN E D, BELLOSTAS N, STROBELB W, et al. Influence of pressure/temperature treatments on glucosinolate conversion in broccoli (BrassicaoleraceaeL. cv Italica) heads[J]. Food Chemistry, 2009, 112(3):646-653.

[15] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部. NY/T1582—2007,油菜籽中硫代葡萄糖苷的測定高效液相色譜法[S]. 北京: 中國標準出版社, 2007.

[16] MICHINTON I, SANG J, BURKE D, et al. Separation of desulphoglucosinolates by reversed-phase high-performance liquid chromatography[J]. Journal of Chromatography A, 1982, 247(1):141-148.

[17] ALEKSANDROVA L G, KOROLEV A M, PREOBRAZHENSKAYA M N. Study of natural ascorbigen and related compounds by HPLC[J]. Food Chemistry, 1992, 45(1):61-69.

[18] 何洪巨, 陳杭, SCHNITZLER H. 中國十字花科蔬菜品種硫代葡萄糖苷組成與含量[C].中國園藝學會青年學術討論會. 北京:中國園藝學會,2000:294-299.

[19] 弓志青, 張慜, 劉春泉. 甘藍不同部位及加工對硫代葡萄糖苷組分和含量的影響[J]. 中國食品學報, 2011, 11(4):218-223.

[20] 王會霞, 李晨, 薛峰,等. 加工處理方式對沖菜中硫代葡萄糖苷的影響[J]. 食品科學, 2011, 32(7):168-172.

[21] WENNBERG M, EKVALL J, OLSSON K, et al. Changes in carbohydrate and glucosinolate composition in white cabbage (Brassicaoleracea, var. capitata ) during blanching and treatment with acetic acid [J]. Food Chemistry, 2006, 95(2):226-236.

[22] 何湘漪, 何洪巨, 范志紅,等. 烹調(diào)方法對3種十字花科蔬菜中硫代葡萄糖苷物質(zhì)保存的影響[J]. 中國食品學報, 2013, 13(8):124-131.

[23] CISKA E, KOZLOWSKA H. The effect of cooking on the glucosinolates content in white cabbage[J]. European Food Research and Technology, 2001, 212(5): 582-587.

[24] OERLEMANS K, BARRETT D M, SUADES C B, et al. Thermal degradation of glucosinolates in red cabbage[J]. Food Chemistry, 2006, 95(1):19-29.

[25] EAS R, HEANEY R K. The effect of cooking and processing on the glucosinolate content: studies on four varieties of Portuguese cabbage and hybrid white cabbage[J]. Journal of the Science of Food & Agriculture, 1993, 62(3):259-265.

[26] EWA CIESLIK, TERESA LESZCZYNSKA, AGNIESZKA FILIPIAK-FLORKIEWICZ, et al. Effects of some technological processes on glucosinolate contents in cruciferous vegetables[J]. Food Chemistry, 2007, 105(3):976-981.

[27] BJERGEGAARD C, SORENSEN H. Characterization of proteins, including myrosinases, associated to rapeseed dietary fibres, compared to proteins in pea dietary fibres[J]. Polish Journal of Food and Nutrition Science, 1995,4(2):47-57.

[28] KAPUSTA-DUCH J, KUSZNJEREWICZ B, LESZCZYNSKA T, et al. Effect of cooking on the contents of glucosinolates and their degradation products in selected Brassica, vegetables[J]. Journal of Functional Foods, 2016, 23:412-422.

[29] CISKA, E, VERKERK, R, HONKE, J. Effect of boiling on the content of ascorbigen, indole-3-carbinol, indole-3-acetonitrile, and 3,3′-diindolylmethane in fermented cabbage[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57(6):2 334-2 338.