周 潔,閆麗華,王 沛,楊潤強,謝 翀

南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院,江蘇 南京 210095

油菜為十字花科、蕓薹屬植物,是我國四大油料作物之一,可分為芥菜油菜、白菜型油菜和甘藍型油菜三大品種[1]。油菜籽加工成菜籽油后可產(chǎn)生50%～55%的菜籽粕,其蛋白質(zhì)含量較高(約35%)且氨基酸組成合理均衡,消化率高[2]。然而,菜籽粕中含有較多的抗?fàn)I養(yǎng)成分,包括硫代葡萄糖苷、植酸和單寧[3]等,限制了其在飼料和食品中的應(yīng)用,但硫代葡萄糖苷因獨特的生理活性受到廣泛關(guān)注[4]。

硫代葡萄糖苷簡稱硫苷,是十字花科類植物中存在的一類重要的次生代謝產(chǎn)物,其在黑芥子酶的催化下可被轉(zhuǎn)化為異硫氰酸酯、惡唑烷硫酮和腈類等多種產(chǎn)物,目前在油菜籽中發(fā)現(xiàn)的硫苷種類就高達120多種[5],具有多種生理功能,但過量食用也會產(chǎn)生不良影響[2]。由于硫苷的酶解產(chǎn)物異硫氰酸酯具有抗菌[6]、抗氧化[7]、抗癌[8]等多種生理功能,研究硫苷的綠色高效提取工藝可為菜籽粕的高值化利用提供參考。目前,硫苷的提取主要采用浸提法[9]、超聲波萃取法[10]等,通常采用水[11-12]、甲醇[13-14]、氯仿[15]等作為溶劑,但這些方法因操作煩瑣、耗時較長等原因,在硫苷提取中的應(yīng)用有限。王芳等[16]采用78%乙醇溶液從菜籽粕中提取硫苷,最終硫苷提取量為18.72 mg/g;龍芳[17]使用超聲輔助提取的方法,以70%甲醇為提取劑從西蘭花莖中提取硫苷,硫苷提取量達到0.732 mg/mL;F?rster等[18]以70%甲醇為提取劑,硫苷提取量達到118 μmol/g。

菜籽粕中硫苷含量較為豐富,選擇安全試劑并找到高效簡便的硫苷提取方法十分有必要。雖然甲醇對硫苷的提取效果較好,且相關(guān)提取方法較為完善,但考慮到甲醇具有毒性,選用綠色溶劑更具有實際意義和應(yīng)用價值。根據(jù)文獻[16]報道,乙醇對硫苷也有較好的提取效果,故本研究以乙醇為提取劑。在硫苷的諸多檢測方法中,氣相色譜法、高效液相色譜法等耗時較長、工作量較大,相較而言氯化鈀比色法[19]更加快速準確且成本低、靈敏度高,適用于大量樣品的測定分析,故本研究采用氯化鈀法進行硫苷含量的測定。作者以乙醇為提取劑,考察提取時間、料液比、pH值、提取溫度等對硫苷提取量的影響,選擇具有顯著影響的因素進行響應(yīng)面試驗,并探究提取前后菜籽粕中營養(yǎng)物質(zhì)的變化,從而為菜籽粕的高值化利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試材與試劑

菜籽餅粕由南京隆盛植物油脂有限公司提供,所采用的制油工藝為壓榨法。將菜籽餅粕粉碎后過100目篩,于-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

烯丙基硫苷(標(biāo)準品)：法國Extrasynthese公司;乙醇(分析純)、羧甲基纖維素鈉：廣東光華科技股份有限公司;氯化鈀：美國J.T.Baker公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FSD-100A電動磨粉機：臺州市新恩精密糧儀有限公司;TDL-5-A離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠;WH-3微型旋渦混合儀：上海瀘西分析儀器廠;HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司;JA2003電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司;MUL 9000(B)-H-30超純水系統(tǒng)：昆山總馨機械有限公司;KQ-250DB數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司;DHG-9030A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技有限公司;UV-2802紫外-可見分光光度計：尤尼柯上海儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 硫苷提取方法

參考Alexandre等[20]的方法并稍加修改。0.2 g菜籽餅粕中加入2 mL一定pH值的70%乙醇溶液,70 ℃水浴15 min進行滅酶處理。滅酶后于一定溫度下水浴一定時間提取硫苷,其間每隔5 min取出渦旋10 s。6 000 r/min離心10 min后吸取上清液至5 mL容量瓶中,超純水定容至5 mL后轉(zhuǎn)移到10 mL離心管中,8 000 r/min離心10 min后取上清液測定硫苷提取量。為避免溶劑沸騰汽化,采用密閉的離心管為提取容器,并在離心管內(nèi)加入少量沸石以防止在加熱提取的過程中出現(xiàn)沸騰現(xiàn)象。提取完成后提取液先于水中降至常溫再取出進行后續(xù)試驗。

1.3.2 硫苷提取優(yōu)化試驗

單因素試驗：以硫苷提取量作為考察指標(biāo),提取時間選擇5、10、20、30、40、50 min,提取溫度選擇40、50、60、70、80、90 ℃,pH值選擇3、4、5、6、7。

響應(yīng)面試驗：在單因素試驗的基礎(chǔ)上以硫苷提取量為響應(yīng)值進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗,采用Design-Expert對試驗數(shù)據(jù)進行線性回歸和方差分析,得出最佳提取條件。

1.3.3 硫苷初提取物的醇沉處理

硫苷初提取物的醇沉操作參考Hui等[21]的方法并稍加修改。稱取一定量的硫苷初提取物于燒杯中,按料液比1∶50 g/mL加入90%的乙醇溶液,攪拌2 h后靜置過夜。4 ℃下8 000 r/min離心20 min,上清液即為醇沉后的硫苷溶液,合并上清液,旋蒸除去大部分乙醇后預(yù)凍于-80 ℃冰箱內(nèi),凍干后即為醇沉后的硫苷提取樣品。

1.4 測定指標(biāo)

1.4.1 硫苷提取量測定

硫苷標(biāo)準曲線繪制：準確稱取5 mg烯丙基硫苷(Sinigrin,C10H16KNO9S2)標(biāo)準品于5 mL離心管中,加入2.2 mL超純水配制成5.72 μmol/mL的烯丙基硫苷標(biāo)準溶液。取7支10 mL離心管,依次加入配制好的烯丙基硫苷標(biāo)準溶液0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL,并用超純水補足至0.8 mL,再依次加入2 mL 0.1%羧甲基纖維素鈉溶液和1 mL氯化鈀溶液,于24 ℃水浴2 h后以第1支離心管內(nèi)溶液作為參比溶液,于540 nm處測定其他溶液的吸光度,以硫苷濃度作為橫坐標(biāo),以吸光度作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準曲線。

硫苷提取量測定：加入分散劑羧甲基纖維素鈉溶液,可使硫苷與氯化鈀反應(yīng)生成有色硫苷鈀溶膠清液,硫苷含量越高,溶液顏色越深,從而通過比色法對硫苷進行定量[22]。參考賀霞等[22]的方法并稍加修改,取1.3.1中制備好的硫苷提取液1.5 mL于10 mL離心管中,并用超純水補足至2 mL,再依次加入2 mL 0.1%羧甲基纖維素鈉溶液和1 mL氯化鈀,24 ℃水浴反應(yīng)2 h。用分光光度計在波長540 nm的條件下,以羧甲基纖維素鈉-氯化鈀空白溶液作為參比溶液,測定各硫苷提取液的吸光度,再根據(jù)烯丙基硫苷標(biāo)準曲線計算樣品中的硫苷提取量。

硫苷提取量(mg/g)=C×V×397/m,

式中：C為由烯丙基硫苷標(biāo)準曲線計算得到的相應(yīng)硫苷濃度,μmol/mL;m為稱取的菜籽粕粉末的質(zhì)量,g;V為制得硫苷提取液的總體積,mL。

1.4.2 粗蛋白、脂肪及總糖含量測定

粗蛋白含量的測定參照GB/T 6432—2018;脂肪含量的測定參照GB 5009.6—2016;總糖含量的測定參照GB 5009.8—2016。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗設(shè)3次重復(fù),結(jié)果換算成硫苷提取量(mg/g),以平均值±標(biāo)準差表示,數(shù)據(jù)采用Design Expert 8.1.6(Version 8.1.6 Stat-Ease Inc.,Minneapolis,MN,USA)軟件進行處理,利用SPSS 19.0進行顯著性分析,采用Duncan′s進行均值間的多重比較,設(shè)定顯著性水平為P<0.05,極顯著水平為P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取時間

由圖1可知,在提取劑為70%乙醇、料液比為1∶10、提取溫度為60 ℃、pH 7的條件下,隨著提取時間的延長,硫苷提取量不斷增加,由5 min時的19.16 mg/g逐步增加至30 min的23.12 mg/g,此時提取液中硫苷含量達到峰值,此后隨著提取時間的繼續(xù)延長,硫苷提取量出現(xiàn)小幅下降,下降幅度約0.5 mg/g?？赡苁怯捎谔崛∵^程屬于溶液內(nèi)部成分的擴散反應(yīng)過程,因此溶液內(nèi)部溶質(zhì)成分的分解及擴散需要一定的時間[23],故當(dāng)提取時間較短時,菜籽粕中的硫苷還未能與提取劑乙醇充分接觸,硫苷不能及時溶出,故導(dǎo)致硫苷提取量較低;而提取時間過長,菜籽粕中的硫苷已基本溶出,乙醇提取劑與硫苷之間達到動態(tài)平衡,繼續(xù)增加提取時間,反而會導(dǎo)致菜籽粕中其余雜質(zhì)溶出,從而使提取液中硫苷純度下降,故確定最佳提取時間為30 min。研究表明,過長的時間可能造成硫苷的降解或雜質(zhì)溶出,導(dǎo)致最終提取量下降。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2、圖3同。圖1 提取時間對硫苷提取量的影響Fig.1 Effects of extraction times on the glucosinolates yield

2.1.2 提取溫度

由圖2可知,在提取劑為70%乙醇、料液比為1∶10、提取時間為10 min、pH 7的條件下,隨著提取溫度的不斷升高,硫苷提取量也相應(yīng)提高,50～70 ℃時硫苷提取量升高并不顯著,僅由20.32 mg/g增至20.89 mg/g,增幅僅為0.57 mg/g。而當(dāng)提取溫度升高至80 ℃時,硫苷提取量顯著增加,由20.89 mg/g增至24.46 mg/g,增幅較大,為3.6 mg/g。而后隨著溫度的繼續(xù)升高,硫苷提取量逐漸趨于穩(wěn)定。這可能是由于提取過程屬于溶液內(nèi)部成分的擴散反應(yīng)過程,溫度升高可使擴散反應(yīng)加劇,促使提取劑乙醇與菜籽粕中的硫苷不斷接觸,加快硫苷的溶出速率,從而使提取量上升[18]。但考慮到提取溫度過高可能會使得提取液中的部分硫苷發(fā)生降解而導(dǎo)致提取量下降,故確定最佳提取溫度為80 ℃。

圖2 提取溫度對硫苷提取量的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the glucosinolates yield

2.1.3 提取pH 值

由圖3可知,在提取劑為70%乙醇、料液比為1∶10、提取時間為10 min、提取溫度為60 ℃的條件下,當(dāng)pH值在3～7的范圍內(nèi)變化時,硫苷提取量沒有發(fā)生明顯的變化,最大提取量是pH 3時的21.2 mg/g,最小提取量是pH 4時的20.31 mg/g,僅差0.9 mg/g,可見pH值對菜籽粕中硫苷提取量的影響不明顯,因此在后續(xù)響應(yīng)面試驗設(shè)計優(yōu)化中不再考慮pH值。

圖3 提取pH值對硫苷提取量的影響Fig.3 Effect of extraction pH on the glucosinolates yield

雖然pH值對硫苷提取量的影響不明顯,但硫苷本身對pH值是比較敏感的,隨著pH值的降低,硫苷的提取量也會不斷提升,相較而言中性環(huán)境下大部分硫苷具有較好的穩(wěn)定性[24]。同時考慮到氯化鈀法測定的是總硫苷含量,pH值的顯著影響或許只針對某種特定品種的硫苷,而對整體硫苷提取量的影響并不十分顯著[25]。因此綜合考慮,選擇pH 7進行硫苷的提取和儲存。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

2.2.1 試驗設(shè)計與結(jié)果

以硫苷提取量為響應(yīng)值,采用Design-expert 8.05設(shè)計兩因素三水平的響應(yīng)面試驗,如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 1 Response surface experimental design and results

2.2.2 回歸方程與方差分析

對試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合,得到擬合方程：Y=25.6+0.86A+6.99B-0.23AB-1.47A2+2.4B2-1.38A2B-1.11AB2,方差分析見表2。

表2 回歸模型的方差分析Table 2 Analysis of variance of regression model

由表2可知,該模型的P為0.000 9,說明回歸方程較為顯著;R2=0.997 0,說明該方程的擬合度較好;失擬項P>0.05,不顯著,說明模型合適;變異系數(shù)為0.67%<15%,說明預(yù)計結(jié)果比較準確可信。對回歸方程中各數(shù)據(jù)進一步分析可知,單因素對硫苷提取量的影響程度為提取溫度(B)>提取時間(A),影響極為顯著的有B、A2、B2(P<0.01),較為顯著的有A、A2B、AB2(P<0.05)。

2.2.3 因子交互作用分析

提取溫度和提取時間交互作用影響硫苷提取量的曲面和等高線見圖4,當(dāng)提取時間一定時,隨著提取溫度的增加,硫苷提取量呈現(xiàn)逐步上升的趨勢;當(dāng)提取溫度一定時,隨著提取時間的增加,硫苷提取量呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢,且響應(yīng)面坡度比較陡峭,說明提取溫度和提取時間的交互作用比較顯著。

圖4 提取溫度和提取時間交互作用影響硫苷提取量的響應(yīng)曲面和等高線Fig.4 Response surface and contour plots for the effect of variables on the extraction volume of glucosinolates versus extraction time and extraction temperature

2.2.4 模型優(yōu)化與驗證

通過軟件分析響應(yīng)曲面模型得出最佳提取條件：提取時間28.87 min,提取溫度90 ℃,在此條件下預(yù)測硫苷提取量為35.01 mg/g,綜合考慮工業(yè)化及實際操作等因素后修正最佳提取條件：提取時間28 min、提取溫度90 ℃,進行3次平行驗證試驗,硫苷提取量為34.32 mg/g,與理論值的相對誤差為2.0%,證明試驗結(jié)果與模型擬合較好。

2.3 菜籽粕及硫苷提取物主要成分分析

為充分了解菜籽粕主要營養(yǎng)成分的變化,對菜籽粕提取前后以及醇沉前后的提取物進行了主要成分分析。

2.3.1 菜籽粕提取前后主要營養(yǎng)成分分析

菜籽粕提取前后的主要成分含量如表3所示,菜籽粕中硫苷含量與總糖含量發(fā)生明顯變化,其中,硫苷含量由提取前的3.77%下降至提取后的0.37%,下降幅度達90%,相比之下總糖含量下降幅度稍小,約為70%。而提取前后菜籽粕中的粗蛋白與脂肪含量則出現(xiàn)一定程度的上升,粗蛋白含量由提取前的32.41%上升至提取后的42.76%,上升幅度約為30%;脂肪含量則由提取前的3.52%上升至提取后的4.93%,上升幅度約為40%。

表3 提取前后菜籽粕的主要成分Table 3 Main components of rapeseed meal before and after extraction %

通過菜籽粕提取前后主要成分的對比可知,90%的硫苷已被提取出來,可見提取方法效率較高。有研究表明由于前處理方式的不同,菜籽粕蛋白質(zhì)的溶解度在35%～88%之間變動[26]。蛋白質(zhì)較難溶于有機溶劑,采用70%乙醇作為提取劑,雖一部分蛋白質(zhì)會溶于水中,但較大部分蛋白質(zhì)仍殘留于菜籽粕中,硫苷提取物中的蛋白質(zhì)含量僅為13.12%。經(jīng)過提取處理后的菜籽粕中硫苷含量不到0.4%,但是蛋白質(zhì)含量達42%左右,因而有潛力被開發(fā)成一種高蛋白原料應(yīng)用到飼料或食品中。

2.3.2 硫苷提取物醇沉前后主要成分分析

硫苷提取物醇沉前后的主要成分含量如表4所示,硫苷初提取物中粗蛋白含量僅為13.12%,與原菜籽粕的(32.41%)相比較低,但硫苷初提取物中總糖含量明顯較高,達到33.56%。同時,提取物中硫苷所占比例仍較低,僅為7.67%,由于3,5-二硝基水楊酸比色法僅能測定樣品中的還原糖,因此剩余組分猜測為大部分粗纖維及一小部分水分。

表4 硫苷提取物主要成分分析Table 4 Analysis of the main components of glucosinolates extraction %

與硫苷初提取物相比,通過乙醇的醇沉作用,初提取物中的總糖含量大幅度降低,由33.56%降至13.01%。同時,硫苷含量也得到了明顯提升,從初提取物中的7.67%升高至醇沉后的17.79%,增幅約130%。此外,脂肪含量也出現(xiàn)一定程度的上升,由初提取物中的8.10%升高至醇沉后的13.54%,增幅約60%。

試驗表明菜籽粕中大部分的糖會被提取液所溶解,菜籽粕中超過70%的糖被提取出來,硫苷提取物中的總糖含量較高,達到33.56%,從而導(dǎo)致硫苷提取物中硫苷含量仍較低,約為7.67%。為了進一步提高最終樣品內(nèi)的硫苷含量,采用醇沉法去除硫苷提取物中的一部分糖類,有研究表明醇含量在50%～60%時可除去淀粉,醇含量在75%時可除去蛋白質(zhì),醇含量達80%時可以除去蛋白質(zhì)、多糖、無機鹽[27]。因此,本研究嘗試采用90%乙醇對硫苷提取凍干物進行醇沉處理,以進一步除去初提取物中的蛋白質(zhì)與糖類。由表4可知,雖然醇沉處理對蛋白質(zhì)的去除效果不是很顯著,但醇沉后樣品中的總糖含量發(fā)生明顯下降,降幅達60%,同時硫苷含量大幅上升,升幅達130%,同時醇沉后的硫苷提取物中各主要成分的比例較為均勻,較有利于后續(xù)的試驗。

3 結(jié)論

單因素試驗結(jié)果顯示提取溫度與提取時間對硫苷提取量有明顯影響,響應(yīng)面試驗結(jié)果則顯示提取溫度相較于提取時間對硫苷提取量的影響更大,而硫苷提取量隨提取時間的增加呈現(xiàn)先逐漸上升后略微下降的趨勢。最佳條件為提取時間28 min、提取溫度90 ℃,硫苷提取量達到34.32 mg/g,可將菜籽粕中90%的硫苷提取出來。本研究確定的菜籽粕硫苷提取方法具有綠色、高效等優(yōu)點,所得硫苷可進一步通過醇沉法進行純化后用于開發(fā)相關(guān)生物制劑,且提取后的菜籽粕硫苷含量大幅度下降,而蛋白質(zhì)含量仍在42%以上,可用作食品或飼料原料,為菜籽粕的高值化利用提供參考。今后可深入探究如何通過酶解等方式將純化所得的硫苷進行定向轉(zhuǎn)化,生產(chǎn)具有抗菌、抑癌等特殊生物活性的成分,從而進一步提高菜籽粕的附加值。