林世鋒，王仁剛，余婧，任學(xué)良，張潔，余世洲

貴州省煙草科學(xué)研究院，煙草行業(yè)分子遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽龍灘壩路29號 550081

青枯勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的煙草青枯病是世界范圍的毀滅性土傳病害，給煙草生產(chǎn)帶來巨大損失[1]。目前國內(nèi)外對煙草抗青枯病的分子機(jī)理研究甚少，對控制青枯病的抗性基因數(shù)目、作用機(jī)制、煙草與青枯菌互作機(jī)理還不清楚。從轉(zhuǎn)錄組水平上分析和挖掘煙草品系中可能存在的抗青枯病基因，不僅能從分子水平上加深對煙草與青枯菌互作的認(rèn)識，還將有助于青枯病抗源合理利用和抗病育種工作。

環(huán)核苷酸（cAMP/cGMP）是生命體重要的信號分子，環(huán)核苷酸門控離子通道（Cyclic nucleotidegated channel，CNGC）是環(huán)核苷酸主要受體之一，參與調(diào)控植物的生長、發(fā)育以及抗病等反應(yīng)[2]。目前已在植物中克隆并鑒定了多個環(huán)核苷酸門控離子通道基因，Clough等[3]在篩選植物抗病突變體時發(fā)現(xiàn)AtCNGC2參與了植物響應(yīng)病原微生物誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，病原菌（Pseudomonas syringae）在cngc2突變體上生長速度變慢，不能產(chǎn)生相應(yīng)的過敏性反應(yīng)（Hypersensitive response，HR），原因是cngc2突變體中水楊酸（Salicylic acid，SA）含量持續(xù)上升，導(dǎo)致病程相關(guān)（pathogenesis-related，PR）基因的持續(xù)表達(dá)，從而造成病原菌不能正常生長。電生理學(xué)分析顯示，cngc2突變體胞內(nèi)cAMP激活的鈣離子流缺失，從而破壞胞內(nèi)NO（nitric oxide）的產(chǎn)生，造成植物免疫反應(yīng)的改變[4-5]。AtCNGC4也參與植物對病原微生物的抗性反應(yīng)，AtCNGC4與AtCNGC2的同源性最高，其突變體與cngc2的表型一致，表現(xiàn)出PR基因的持續(xù)表達(dá)，水楊酸含量處于高水平等現(xiàn)象[6-7]。敲除AtCNGC11和AtCNGC12可降低植物對病原菌（Hyaloperonospora arabidopsidis）的抵抗能力，表明二者在植物抗病信號途徑中是正調(diào)控因子[8]。此外，大麥NEC1基因的序列與AtCNGC4基因相似，其突變體表型與cngc4的相同，表現(xiàn)出PR基因的上調(diào)表達(dá)[9]。因此可以認(rèn)為，CNGC既參與雙子葉植物的抗病反應(yīng)，又參與單子葉植物的抗病反應(yīng)。

基于前期發(fā)現(xiàn)的CNGC基因家族成員在抗病煙草材料中上調(diào)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄組結(jié)果，本研究克隆了該CNGC基因家族成員NtCNGC1，熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)NtCNGC1在煙草DB101根中高水平表達(dá)，對比抗、感煙草材料接種青枯病菌后NtCNGC1表達(dá)量，進(jìn)一步證明了該基因與煙草抗青枯病相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

強(qiáng)致病力煙草青枯病菌由貴州省煙草科學(xué)研究院煙草行業(yè)分子遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并繼代保存于TTC培養(yǎng)基。煙草青枯病抗病品種DB101和易感品種紅花大金元由貴州省煙草科學(xué)研究院良種繁育中心提供，采用漂浮育苗，待煙苗長至2～3片真葉時，移栽至花盆中（泥炭土：蛭石：珍珠巖=1：1：1）培養(yǎng)。

1.2 NtCNGC1基因的克隆

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中的煙草CNGC1基因序列（登錄號：XM_016655150）設(shè)計(jì)克隆引物CNGC1-F和CNGC1-R（表1）。提取DB101煙草葉片總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為模版對煙草CNGC1基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆和測序。同時，從DB101煙草葉片中提取基因組DNA，作為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆和測序。

1.3 NtCNGC1基因的生物信息學(xué)分析

采用SMART在線工具h(yuǎn)ttp∶//smart.embl-heidelberg.de/檢索保守模體；采用PlantCARE在線工具h(yuǎn)ttp∶//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/預(yù)測啟動子的順時作用元件；采用ClustalX 2.0軟件對齊所有CNGC序列；采用MEGA4.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，方法為鄰接法，自舉檢測次數(shù)為1000。

1.4 NtCNGC1基因的熒光定量PCR表達(dá)分析

當(dāng)煙苗長至5～6片真葉時，選取DB101和紅花大金元生長狀況一致的煙苗，參照Marco等[10]的方法接種青枯病菌，以蒸餾水處理煙苗作為對照。分別在接種后3、6、12、24和48 h取接種葉片作為檢測樣品；并在DB101苗期和旺長期，取中部葉、莖和根作為檢測樣品，所有樣品液氮速凍保存。采用Trizol試劑盒（Invitrogen公司）提取各樣品的總RNA，DNaseⅠ除去基因組DNA后，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，熒光定量PCR進(jìn)行煙草CNGC1基因的表達(dá)分析。基因擴(kuò)增上游引物為CNGC1-rF、下游引物為CNGC1-rR，以煙草β-actin基因作為內(nèi)參，內(nèi)參基因擴(kuò)增中所用上下游引物為Actin-rF和Actin-rR（表1）。各處理樣品進(jìn)行3次重復(fù)。采用2-ΔΔCT法進(jìn)行基因相對定量分析[11]。

表1 NtCNGC1基因的克隆和表達(dá)分析引物Tab. 1 Primers used for cloning and expression analysis of NtCNGC1 gene

2 結(jié)果與分析

2.1 NtCNGC1基因的序列特征

分別以煙草基因組DNA和cDNA為模板，用引物對CNGC1-F/CNGC1-R擴(kuò)增出目的條帶（圖1）。測序結(jié)果表明，NtCNGC1基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物長度為6519 bp，cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物長度為2445 bp，其中編碼區(qū)全長為2154 bp。該基因具有7個內(nèi)含子，第7內(nèi)含子最長，為952 bp，第6內(nèi)含子次之，為659 bp，第2內(nèi)含子最短，僅86 bp；8個外顯子中，第2外顯子最長，為565 bp，其次為第7外顯子，長度為476 bp，第5外顯子最短，僅112 bp（圖2）。

圖1 煙草NtCNGC1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of NtCNGC1 from Nicotiana tabacum

圖2 NtCNGC1的基因結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2 Gene schematic structure of NtCNGC1

2.2 NtCNGC1編碼蛋白的特征

NtCNGC1編碼717個氨基酸（圖3），等電點(diǎn)為9.35，分子量為83 kDa。SMART在線工具檢索發(fā)現(xiàn)，NtCNGC1編碼蛋白有6個保守結(jié)構(gòu)域（圖4），分 別 位 于 97～118，133～152，185～207，257～279，380～402和488～619氨基酸殘基位置，N端為5個連續(xù)的跨膜結(jié)構(gòu)域（Transmembrane region），C端為環(huán)化核苷酸結(jié)合域（Cyclic nucleotide-monophosphate binding domain，cNMP）。

圖3 NtCNGC1的編碼區(qū)及推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列Fig.3 Coding sequence and its deduced protein sequence of NtCNGC1

圖4 NtCNGC1的保守模體Fig.4 Conserved motifs of NtCNGC1

2.3 NtCNGC1基因的上游啟動子分析

啟動子預(yù)測結(jié)果表明，位于NtCNGC1基因起始密碼子ATG的5′區(qū)上游 1500 bp的啟動子核苷酸序列具有多種順式作用元件（表2），包括與光響應(yīng)、真菌激發(fā)子響應(yīng)、熱響應(yīng)、干旱響應(yīng)、傷口響應(yīng)、水楊酸響應(yīng)、厭氧誘導(dǎo)、防御與應(yīng)激反應(yīng)、病原菌應(yīng)答、木質(zhì)部誘導(dǎo)性表達(dá)和韌皮部阻遏性表達(dá)、代謝調(diào)節(jié)及器官發(fā)育等相關(guān)元件。

表2 NtCNGC1基因上游調(diào)控區(qū)順式作用元件Tab. 2 Cis-elements in the upstream regulation region of NtCNGC1 gene

2.4 NtCNGC1的系統(tǒng)進(jìn)化分析

根據(jù)CNGC序列中的2個功能結(jié)構(gòu)域，比較NtCNGC1與全部擬南芥CNGC蛋白家族成員和部分煙草、大麥、蒺藜苜蓿、水稻中假定的CNGC之間的親緣關(guān)系，結(jié)果表明（圖5），CNGC 主要分成5個亞組（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳa、Ⅳb），其中，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ親緣關(guān)系很近，它們與另外兩個亞組Ⅳa和Ⅳb的關(guān)系較遠(yuǎn)。NtCNGC1與擬南芥抗病正調(diào)控因子AtCNGC11、AtCNGC12和AtCNGC11/12嵌合體同屬于CNGC家族的第Ⅰ亞組，而擬南芥抗病負(fù)調(diào)控因子AtCNGC2和AtCNGC4屬于CNGC家族的第Ⅳb亞組。

圖5 植物CNGCs的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of plant cyclic nucleotide-gated channels

2.5 NtCNGC1基因的表達(dá)分析

為了驗(yàn)證NtCNGC1基因的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)結(jié)果，利用熒光定量PCR檢測NtCNGC1響應(yīng)青枯病菌侵染的表達(dá)情況。在煙草青枯病菌侵染后，抗病品種DB101中NtCNGC1基因的表達(dá)量從3 h 開始就有上調(diào)表達(dá)趨勢，而感病品種紅花大金元在12 h才表現(xiàn)出上調(diào)表達(dá)，且表達(dá)量前者明顯高出后者（圖6），這一表達(dá)變化趨勢與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果基本一致。熒光定量PCR進(jìn)一步檢測NtCNGC1基因在抗病煙草DB101中的組織表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在苗期和旺長期NtCNGC1在根中表達(dá)量最高，莖中其次，葉中最低（圖7）。

圖6 煙草接種青枯病菌病后NtCNGC1基因的表達(dá)分析Fig.6 Expression level of NtCNGC1 gene in response to Ralstonia solanacearum

圖7 NtCNGC1基因在不同組織中的表達(dá)分析Fig.7 Expression level of NtCNGC1 gene in different organs

3 討論與結(jié)論

本課題組在前期煙草響應(yīng)青枯病菌侵染的轉(zhuǎn)錄組研究中發(fā)現(xiàn)NtCNGC1基因（XM_016655150）可能參與抵抗煙草青枯菌侵染的防衛(wèi)反應(yīng)。為進(jìn)一步驗(yàn)證NtCNGC1基因的這一功能，本試驗(yàn)克隆了NtCNGC1基因。熒光定量PCR證實(shí)NtCNGC1基因在抗病煙草品種DB101中上調(diào)表達(dá)，而在感病煙草品種紅花大金元中無明顯表達(dá)變化，初步說明NtCNGC1基因在抗病煙草中可以響應(yīng)青枯菌的侵染。而且NtCNGC1基因的表達(dá)具有組織特異性，主要在根中表達(dá)，這與青枯菌在煙草根部侵染的特點(diǎn)相吻合。基于上述研究結(jié)果推測NtCNGC1是煙草抗青枯病相關(guān)基因。

大量研究表明，激素信號在植物抗病反應(yīng)中具有重要的作用，一些抗病基因通過一個或幾個激素信號通路的調(diào)控發(fā)揮其重要功能[12-13]。本研究結(jié)果顯示，NtCNGC1基因的啟動子區(qū)域含有多個與植物抗病或激素應(yīng)答相關(guān)的順式作用元件，如病原菌應(yīng)答元件W-Box、真菌誘導(dǎo)元件Box-W1、防御及脅迫響應(yīng)元件TC-rich repeats、以及水楊酸響應(yīng)元件TCA-element，暗示NtCNGC1基因可能通過響應(yīng)水楊酸信號參與煙草對青枯菌的抵御過程。有關(guān)CNGC在響應(yīng)水楊酸信號調(diào)控植物防御反應(yīng)中的作用研究已有報(bào)道，Moeder等[14]的研究結(jié)果表明，擬南芥AtCNGC2和AtCNGC4的表達(dá)受非致病性病原菌Pst DC3000（AvrRps4）和水楊酸的負(fù)調(diào)控，而擬南芥AtCNGC11和AtCNGC12的表達(dá)受非致病性病原菌Pst DC3000（avrRpt2）和水楊酸的正調(diào)控，推測前兩者在水楊酸和R基因介導(dǎo)的防御信號途徑中為負(fù)調(diào)控因子，而后兩者為正調(diào)控因子。考慮到煙草NtCNGC1與擬南芥AtCNGC11和AtCNGC12同屬于CNGC家族的第Ⅰ亞組，且有報(bào)道顯示水楊酸誘導(dǎo)煙草對煙草青枯菌的抗性[15-16]，推測煙草NtCNGC1基因作為正調(diào)控因子參與水楊酸和R基因介導(dǎo)的煙草青枯病抗性。

綜上，本研究從煙草中克隆到NtCNGC1，生物信息學(xué)和表達(dá)分析表明該基因的表達(dá)具有組織特異性，并受青枯菌誘導(dǎo)，未來將通過轉(zhuǎn)基因和基因敲除方法對該基因的功能進(jìn)行驗(yàn)證。