楊曉龍，韓海玉，王富平

（1.西藏山南市畜牧獸醫(yī)總站 856000；2.西藏昌都市畜牧總站 854000；3.西藏山南市畜牧獸醫(yī)總站 856000）

大腸埃希菌對(duì)嬰兒和幼畜(禽)，常引起嚴(yán)重腹瀉和敗血癥，要從根本上預(yù)防和治療由大腸埃希菌引起的此類疾病，制備免疫保護(hù)力高的疫苗被當(dāng)前醫(yī)學(xué)界認(rèn)為是最有效的途徑之一。本實(shí)驗(yàn)以仔豬源致病性大腸埃希菌為材料，采用培養(yǎng)后大腸埃希菌制成菌液與氫氧化鋁佐劑、維生素E佐劑和黃芪多糖佐劑分別制備免疫原。免疫家兔測(cè)其抗體效價(jià)，以期篩選出優(yōu)良佐劑，為地區(qū)仔豬大腸埃希菌病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：大腸埃希菌O144（編號(hào)為2-1-2），分離自青海省互助縣某豬場(chǎng)。

養(yǎng)基及試劑：營(yíng)養(yǎng)肉湯，營(yíng)養(yǎng)瓊脂，黃芪多糖注射液，維生素E軟膠囊，三氯化鋁。

試驗(yàn)動(dòng)物 ：非免疫健康兔，體重為2～3kg。

實(shí)驗(yàn)儀器：磁力攪拌器、微型振蕩器、高壓鍋、恒溫箱、離心機(jī)、4℃冰箱等。

1.2 方法

制備菌懸液：將大腸埃希菌O144（2-1-2）接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂，37℃培養(yǎng)24h后用滅菌生理鹽水洗下，制備濃度達(dá)到20億/m1的菌懸液，最后加入終濃度為0.4%的甲醛溶液，充分混合后置于37℃滅活48h。

無(wú)菌檢驗(yàn)：將滅活的菌懸液接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯，37℃培養(yǎng)48h，經(jīng)檢驗(yàn)無(wú)菌生長(zhǎng)者為合格。

制備疫苗：根據(jù)文獻(xiàn)制備氫氧化鋁佐劑苗[1]；根據(jù)文獻(xiàn)資料相關(guān)方法制備礦物油佐劑苗[2]。

檢驗(yàn)疫苗安全性：將制備好的疫苗分別皮下注射3只家兔，1m1/kg·體重，觀察7d，記錄試驗(yàn)家兔精神、運(yùn)動(dòng)和食欲等生理活動(dòng)是否正常。

免疫接種將15只兔分成5組后編號(hào)。1組注射氫氧化鋁佐劑疫苗；2組先肌肉注射1m1/kg·體重黃芪多糖，再用滅活菌懸液免疫；3組先投喂150～300IU/kg·體重維生素E，再用滅活菌懸液免疫試驗(yàn)動(dòng)物；4組注射礦物油佐劑苗；5組注射不含佐劑疫苗。每只兔均皮下注射1m1/kg·體重，多點(diǎn)注射，以便使疫苗較快的吸收。共免疫兩次，第一次注射后經(jīng)14d再注射一次，兩次注射劑量相同。

血清效價(jià)測(cè)定

第二次免疫后14d，無(wú)菌采血分離血清檢測(cè)效價(jià)。

2 結(jié)果

無(wú)菌試驗(yàn)結(jié)果成立；試驗(yàn)動(dòng)物接種疫苗后初期精神怠倦，后好轉(zhuǎn)，其后7d內(nèi)精神、運(yùn)動(dòng)和食欲等生理活動(dòng)未見(jiàn)異常表現(xiàn)，表明注射的疫苗安全性良好。血清效價(jià)測(cè)定結(jié)果詳見(jiàn)表1。

表1 血清效價(jià)測(cè)定結(jié)果表

3 討論

研究顯示同一種抗原與不同佐劑結(jié)合，均能產(chǎn)生一定的免疫結(jié)果，其中采用新型的免疫佐劑均獲得較高的抗體效價(jià)，維生素E佐劑所產(chǎn)生的抗體效價(jià)達(dá)到1：1024，黃芪多糖佐劑達(dá)到1：512，而臨床常用的氫氧化鋁佐劑效價(jià)只達(dá)到1：64，不加佐劑疫苗的抗體效價(jià)只有1：32。說(shuō)明了新型免疫佐劑苗的效果比傳統(tǒng)免疫佐劑苗的效果好很多。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為今后研制免疫強(qiáng)度高效，毒性小，生產(chǎn)程序簡(jiǎn)單，低成本，易于推廣的新型佐劑提供相關(guān)依據(jù)。

研制和開(kāi)發(fā)新的免疫佐劑時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；利用天然材料制備佐劑時(shí)應(yīng)從具有免疫活性的材料中廣泛篩選，進(jìn)一步保證其作為佐劑的可行性；所制備的佐劑化學(xué)成分和生物性狀應(yīng)清晰、穩(wěn)定，易于儲(chǔ)存，不發(fā)生變性；無(wú)短期和長(zhǎng)期的毒副作用；且價(jià)格低廉，所開(kāi)發(fā)的佐劑與抗原聯(lián)合使用可以產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，且進(jìn)入體內(nèi)的佐劑要易于從體內(nèi)自行降解，以期達(dá)到最好的免疫效果。