乙肝相關(guān)肝癌組織中Jagged-1的表達(dá)及其臨床意義

禹建峰，武燁曄，吳衢敏，鄭明生，黃騰飛，楊國榮

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界范圍內(nèi)發(fā)病率第六、死亡率第三的惡性腫瘤[1]。與西方國家不同，我國肝癌的主要病因是慢性乙型肝炎感染，其新發(fā)病例數(shù)約占全球總數(shù)的50%，且發(fā)病率和死亡率呈逐年上升的趨勢(shì)[2]。根治性肝切除術(shù)仍然是乙肝相關(guān)肝癌的主要治療方式之一，但其術(shù)后5年的腫瘤復(fù)發(fā)率約70%，且針對(duì)復(fù)發(fā)腫瘤仍缺少有效的干預(yù)手段[3, 4]。因此，當(dāng)下急需探索可能影響肝癌預(yù)后的新分子、新靶點(diǎn)，將其轉(zhuǎn)化應(yīng)用于臨床，以改善肝癌的治療效果。

Notch信號(hào)通路主要由4個(gè)受體(Notch-1、Notch-2、Notch-3、Notch-4)和5個(gè)配體(Jagged-1、Jagged-2、DLL-1、DLL-3、DLL-4)組成[5]?，F(xiàn)階段Notch信號(hào)通路的配體或者受體對(duì)于不同類型肝臟惡性腫瘤的具體作用及機(jī)制仍不明確[6]。Jagged-1蛋白為Notch的配體之一，文獻(xiàn)[7]報(bào)道它可能參與了肝癌的進(jìn)展，其表達(dá)可能與西方人群的肝癌預(yù)后密切相關(guān)，但其與乙肝相關(guān)肝癌臨床預(yù)后的研究甚少?；诖耍覀儥z測(cè)了110例乙肝相關(guān)肝癌組織及其對(duì)應(yīng)癌旁組織中Jagged-1蛋白的表達(dá)情況，并分析了其與臨床病理和術(shù)后隨訪資料之間的關(guān)系。

1對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 收集2008-11至2012-06就診我院并接受肝切除術(shù)治療的肝癌患者110例。其中，男92例(83.6%)，女18例(16.4%)；平均52.5歲，年齡>50歲的72例(65.5%)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)病理證實(shí)為HCC；(2)乙肝表面抗原陽性；(3)術(shù)前未接受其他任何治療；(4)無其他惡性疾病病史；(5)肝功能Child-Pugh分級(jí)為A或B；(6)無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，主要門靜脈或肝靜脈未發(fā)生腫瘤侵犯。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)長(zhǎng)期飲酒史、非酒精性脂肪肝疾病及丙肝抗體陽性等；(2)臨床資料不全或術(shù)后失訪；(3)手術(shù)切緣陽性。

根據(jù)術(shù)前影像學(xué)對(duì)腫瘤的評(píng)估，以及血生化值、CTP評(píng)分對(duì)肝功能的評(píng)價(jià)制定肝臟切除方案，如果患者全身情況和肝功能均較好、現(xiàn)有的技術(shù)條件下可將腫瘤切除的且術(shù)后有足夠的肝組織剩余，則對(duì)患者實(shí)施肝切除術(shù)。

1.2 組織芯片蠟塊構(gòu)建 收集患者的癌與癌旁的組織蠟塊，經(jīng)HE染色、芯片的設(shè)計(jì)、TMA受體蠟塊的制備、TMA模塊的處理、組織陣塊切片及質(zhì)檢等工序后，最終構(gòu)建成組織芯片。

1.3 免疫組織化學(xué)染色 檢測(cè)Jagged-1蛋白在肝細(xì)胞癌組織及其對(duì)應(yīng)癌旁組織的表達(dá)：組織芯片經(jīng)過拷片、脫蠟、梯度脫水、高壓抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、血清封閉、一抗孵育、二抗孵育、DAB顯色及蘇木精復(fù)染后，采用雙盲法由兩位研究者對(duì)結(jié)果進(jìn)行組織芯片評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：陰性為未染色，陽性為細(xì)胞漿染棕黃色，PBS液代替一抗設(shè)空白對(duì)照。高倍鏡下觀察4個(gè)視野，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，按陽性細(xì)胞的百分比進(jìn)行評(píng)分(0分，全陰性或陽性細(xì)胞≤5%；1分，陽性細(xì)胞6%～20%；2分，陽性細(xì)胞21%～50%；3分，陽性細(xì)胞>50%)。定義0分和1分為低表達(dá)組，2分和3分為高表達(dá)組。

1.4 隨訪和觀察終點(diǎn) 患者術(shù)后第1年每月隨訪一次，隨后每3～6個(gè)月隨訪一次。隨訪時(shí)，常規(guī)檢查全血細(xì)胞計(jì)數(shù)、凝血功能、肝功能、乙肝病毒抗原和抗體、乙肝病毒DNA定量和甲胎蛋白(Alpha fetoprotein，AFP)水平，常規(guī)進(jìn)行腹部超聲，CT和(或)MRI每6個(gè)月進(jìn)行一次，如果懷疑有腫瘤復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移則會(huì)進(jìn)一步檢查。腫瘤復(fù)發(fā)的診斷標(biāo)準(zhǔn)同最初HCC的診斷標(biāo)準(zhǔn)，復(fù)發(fā)的腫瘤采取外科手術(shù)、介入和索拉菲尼等治療手段。本研究隨訪觀察截止日期為2017年6月，患者死亡或腫瘤復(fù)發(fā)作為終點(diǎn)事件，總體生存的計(jì)算是從手術(shù)到死亡或者最后一次隨訪，腫瘤復(fù)發(fā)是從手術(shù)到術(shù)后第一次診斷復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。入組患者未見非腫瘤死亡病例。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用R語言進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。連續(xù)變量采用Studentt檢驗(yàn)，分類變量采用χ2檢驗(yàn)，非正態(tài)分布資料采取Mann-Whitney秩檢驗(yàn)。壽命表法計(jì)算入組患者術(shù)后的復(fù)發(fā)率及生存率；生存或復(fù)發(fā)曲線由Kaplan-Meier法繪制。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 乙肝相關(guān)肝癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織中Jagged-1蛋白的表達(dá) Jagged-1蛋白陽性染色主要位于胞漿中，肝癌組織中Jagged-1蛋白高表達(dá)率(44.5%)顯著高于對(duì)應(yīng)癌旁組織(22.3%)(χ2=12.16，P<0.0001，圖1)。

圖1 乙肝相關(guān)肝癌組織及其對(duì)應(yīng)癌旁組織中Jagged-1蛋白的表達(dá)

A.癌旁組織(SP，×40); B. 癌組織(低表達(dá)組)(SP，×40); C．癌組織(高表達(dá)組)(SP，×40)；D. 癌旁組織(SP，×400); E. 癌組織(低表達(dá)組)(SP，×400); F. 癌組織(高表達(dá)組)中的表達(dá)(SP，×400)

2.2 Jagged-1蛋白的表達(dá)水平與乙肝相關(guān)肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系 Jagged-1高表達(dá)和低表達(dá)組乙肝病毒DNA載量、總膽紅素、白蛋白、凝血酶原時(shí)間、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、甲胎蛋白、肝硬化、腫瘤個(gè)數(shù)、BCLC分期等方面無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，僅MVI這項(xiàng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，高表達(dá)組的MVI發(fā)生率高于Jagged-1蛋白低表達(dá)組(75.5%vs41.0%，P<0.001，表1)。

2.3 Jagged-1蛋白的表達(dá)水平與乙肝相關(guān)肝癌患者臨床預(yù)后的關(guān)系 Jagged-1蛋白高表達(dá)組與低表達(dá)組的1、3、5年總體生存率分別是87.5%、64.1%、46.5% 和 96.7%、84.5%、66.9%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0139)；1、3、5年腫瘤復(fù)發(fā)率為29.8%、53.6%、65.5% 和18.7%、39.9%、53.8%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0903, 圖2)。

變量低表達(dá)組(n=61)高表達(dá)組(n=49)χ2或tP年齡(歲)53.0(45.0～59.0)52.0(43.0～57.0)2.2110.477性別(n;%)0.2590.803 男性52(85.2)40(81.6) 女性9(14.8)9(18.4)HBV-DNA載量(n;%)1.5570.459 ≤104U/ml9(14.8)5(10.2) 104-106U/ml34(55.7)33(67.3) >106U/ml18(29.5)11(22.4)總膽紅素(μmol/L)14.1(11.5～18.3)13.8(9.80～17.4)2.2480.441白蛋白(g/L)40.7(39.3～43.2)41.0(38.3～42.7)1.3820.876ALT(U/L)41.2(29.9～56.5)41.5(32.0～54.2)1.5070.864PT(s)12.3(11.7～13.3)12.1(11.5～12.9)5.1830.222AFP(n;%)1.4730.479 ≤20μg/L21(34.4)21(42.9) >20～400μg/L16(26.2)14(28.6) >400μg/L24(39.3)14(28.6)BCLC分期(n;%)0.7170.515 0/A期35(57.4)32(65.3) B期26(42.6)17(34.7)腫瘤直徑(cm)2.77±0.922.69±0.880.629腫瘤個(gè)數(shù)(n;%)<0.0011 156(91.8)45(91.8) 25(8.20)4(8.16)MVI(n;%)13.170<0.001 是25(41.0)37(75.5) 否36(59.0)12(24.5)肝硬化(n;%)2.5030.17 是47(77.0)31(63.3) 否14(23.0)18(36.7)Edmondson-Steiner評(píng)分(n;%)2.6680.151 I～I(xiàn)I28(45.9)15(30.6) III～I(xiàn)V33(54.1)34(69.4)ChildPugh評(píng)分(n;%)4.4840.166 555(90.2)39(79.6) 66(9.84)8(16.3) 70(0.00)2(4.08)

注：HBV-DNA，乙肝病毒DNA；ALT，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；PT，凝血酶原時(shí)間；AFP，甲胎蛋白；BCLC分期，巴塞羅那臨床肝癌分期；MVI，微小血管侵犯。表1中非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)使用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表達(dá)

圖2 乙肝相關(guān)肝癌術(shù)后Jagged-1高表達(dá)組與低表達(dá)組患者的總體生存率和腫瘤累積復(fù)發(fā)率曲線

3 討 論

Notch信號(hào)通路作用廣泛，它不僅在正常細(xì)胞的增殖、分化及凋亡等方面發(fā)揮了作用，而且還參與了腫瘤新生血管的生成和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[8]。在肝臟研究領(lǐng)域，Notch信號(hào)通路已經(jīng)被證實(shí)可能與肝臟血管、膽管的發(fā)育密切相關(guān)，而且還參與了肝臟損傷的修復(fù)過程[9]。但是，它對(duì)于肝細(xì)胞癌的具體作用和機(jī)制仍存在爭(zhēng)議：有一些研究認(rèn)為，它可能促進(jìn)了HCC的發(fā)生發(fā)展；而另一些研究則認(rèn)為，它可能抑制了HCC的進(jìn)展[10]。關(guān)于Jagged-1蛋白相關(guān)研究主要集中在西方人群，而我國肝細(xì)胞癌患者的病因與西方不同，主要以慢性乙型病毒性肝炎為主。已有研究報(bào)道乙型肝炎X蛋白可能通過活化Notch信號(hào)通路，從而參與了乙肝相關(guān)肝癌的進(jìn)展[11]。鑒于Notch通路上不同配體和受體所激活的下游信號(hào)通路在HCC中發(fā)揮的作用是各不相同的[12]，因此我們課題組挑選了Jagged-1蛋白作為研究對(duì)象。本研究的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)了乙肝相關(guān)性肝癌組織中Jagged-1蛋白的表達(dá)水平升高，且與患者的臨床預(yù)后密切相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，Jagged-1蛋白在部分肝癌組織中較癌旁組織呈相對(duì)高表達(dá)，并且Jagged-1高表達(dá)患者的1、3、5年生存率低于Jagged-1表達(dá)水平低的患者，提示Jagged-1蛋白在乙肝相關(guān)肝癌組織中的表達(dá)水平與臨床預(yù)后相關(guān)。2013年， Razumilava等[13]提出了以Notch信號(hào)通路中被激活的不同配體或者受體作為分子標(biāo)志物，從分子層面對(duì)肝臟惡性腫瘤進(jìn)行重新分型。而本研究結(jié)果也顯示了Notch信號(hào)通路的配體Jagged-1蛋白有希望作為一種新的肝臟腫瘤標(biāo)志物應(yīng)用于臨床的診斷分型、精準(zhǔn)治療及預(yù)后分析等。

本研究結(jié)果還顯示，Jagged-1蛋白的表達(dá)水平與患者肝癌組織的MVI相關(guān)。肝癌的MVI指僅在鏡下可見的肝癌細(xì)胞侵犯門靜脈、肝靜脈或其他由血管內(nèi)皮細(xì)胞包繞的微血管，切除標(biāo)本的總體發(fā)生率21%～57%[14]。肝細(xì)胞癌高轉(zhuǎn)移高復(fù)發(fā)的特性是影響其遠(yuǎn)期療效的主要瓶頸，而MVI是導(dǎo)致肝癌術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的重要危險(xiǎn)因素[15]。文獻(xiàn)[7, 16]報(bào)道，Jagged-1蛋白可能參與了HCC的發(fā)生發(fā)展，并與肝臟血管的發(fā)育形成密不可分。肝細(xì)胞癌是人體最富含血管的惡性腫瘤，現(xiàn)階段以索拉菲尼為代表的抑制血管生成的藥物已廣泛應(yīng)用于臨床，并取得了一定療效。至今已經(jīng)有多種Notch信號(hào)通路相關(guān)的小分子抑制劑和單抗藥物正處于臨床前或早期臨床研究階段，其中Jagged-1的單抗藥物已經(jīng)進(jìn)入了肝纖維化疾病的Ⅰ期臨床實(shí)驗(yàn)，并展示了出了良好的應(yīng)用前景[17]。因此，本研究預(yù)示以Jagged-1為靶點(diǎn)的相關(guān)治療將同索拉菲尼等抑制血管生成藥物一樣，未來將會(huì)在肝細(xì)胞癌治療領(lǐng)域有所建樹。

本研究存在以下不足：(1)樣本量偏小，需要多中心的臨床研究進(jìn)一步證實(shí)我們的研究結(jié)果。(2)本研究利用組織芯片進(jìn)行免疫組化染色，僅從蛋白水平檢測(cè)Jagged-1的表達(dá)。未來還需要通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，從DNA水平、mRNA水平及蛋白水平等多方面對(duì)Jagged-1蛋白的功能和作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。(3)組織芯片上的腫瘤組織僅為原發(fā)腫瘤的一部分，鑒于腫瘤的異質(zhì)性，組織芯片中Jagged-1的表達(dá)水平尚不能完全代替腫瘤整體的表達(dá)水平。

綜上所述，Jagged-1蛋白在乙肝相關(guān)肝癌組織中的表達(dá)水平增高，且與不良的臨床預(yù)后密切相關(guān)，它可能在肝癌的MVI發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用。此項(xiàng)研究為Jagged-1蛋白的臨床轉(zhuǎn)化及應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

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