黎玉涵，孫小麗，何少儀，胡桂英，洪小山，布俏雯，羅喜平

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣東省婦幼保健院，廣州510010)

miRNAs是一類普遍存在的內(nèi)源性小分子非編碼RNA，由18～24個核苷酸組成，通過與靶mRNA 3'端非編碼區(qū)(3′UTR)完全或不完全結(jié)合來影響靶基因的表達，調(diào)控生物體的發(fā)育、增殖、分化、代謝和應(yīng)激反應(yīng)等生理過程[1]。在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，miRNAs通過影響功能蛋白的表達及信號傳導(dǎo)通路網(wǎng)絡(luò)等，參與癌細胞的增殖、遷移、侵襲及凋亡過程，在不同類型惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[2,3]。miR-181a是miR-181家族的一員，其成熟體含23個核苷酸，位于1號染色體。文獻報道m(xù)iR-181a在各類惡性腫瘤中表達,如非小細胞肺癌、口腔鱗狀細胞癌、T淋巴細胞瘤、膠質(zhì)母細胞瘤、乳腺癌等，且影響著惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在不同類型惡性腫瘤中起到癌基因或抑癌基因的作用[4～8]。盡管miR-181a與惡性腫瘤的研究較深入，但與宮頸癌的關(guān)系及調(diào)控作用的研究報道少見。本研究觀察了轉(zhuǎn)染miR-181a模擬物、抑制物的宮頸癌細胞株Siha和Hela增殖、凋亡、遷移情況的變化?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞系和主要試劑 宮頸癌細胞系SiHa及HeLa均購自中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所，由廣州醫(yī)科大學(xué)實驗中心保存。Trizol(Invitrogen)，SYBR Premix Ex Taq熒光定量PCR試劑盒 (TaKaRa)，riboFECT CP Transfection Kit細胞轉(zhuǎn)染試劑盒(廣州市銳博生物科技有限公司)，miR-181a mimics、miR-181a inhibitors及U6引物均由廣州市銳博生物科技有限公司提供; DMEM培養(yǎng)基和RPMI1640培養(yǎng)基(GIBCO)，OPTI-MEM培養(yǎng)基(Invitrogen)，Annexin-V細胞雙染凋亡檢測試劑盒(上海貝博生物)，Transwell小室(Corning)。

1.2 細胞分組及miR-181a模擬物、抑制物轉(zhuǎn)染 Siha細胞培養(yǎng)于含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基中，Hela細胞培養(yǎng)于含10% FBS 的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。分4個實驗。①將體外培養(yǎng)的SiHa細胞分為觀察1組、對照1組和空白1組。觀察1組轉(zhuǎn)染miR-181a模擬物、對照組1組轉(zhuǎn)染無關(guān)序列、空白組只加入試劑。②將體外培養(yǎng)的SiHa細胞分為觀察2組、對照2組和空白2組。觀察2組轉(zhuǎn)染miR-181a抑制物、對照組2組轉(zhuǎn)染無關(guān)序列、空白組只加入試劑。③和④所用細胞為HeLa細胞，其余操作分別和①、②相同。轉(zhuǎn)染試劑采用riboFECT CP Transfection Kit轉(zhuǎn)染試劑盒，按試劑盒說明書操作。

1.3 各組細胞miR-181a檢測 采用實時熒光定量PCR法。按照Trizol試劑盒說明書提取癌組織和細胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,逆轉(zhuǎn)錄條件為25 ℃ 30 mim、42 ℃ 30 mim、85 ℃ 10mim，逆轉(zhuǎn)錄試劑由吉瑪公司提供。cDNA 采用SYBR Seclect Master Mix系統(tǒng)進行實時熒光定量PCR檢測miR-125b的表達，以U6作為內(nèi)參。miR-125b正向引物5′- ACTGATAAATCCCTGAGACCCTAAC-3′，反向引物5′- TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTCAC-3′，U6正向引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′ ，反向引物5′- CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。采用2-ΔΔCT表示miR-181a相對表達量。

1.4 各組細胞增殖情況觀察 采用克隆形成實驗。轉(zhuǎn)染48 h后消化細胞，調(diào)整細胞濃度為500 /mL，接種于6 孔板，每孔2 mL。常規(guī)培養(yǎng)，間隔2～3 d更換培養(yǎng)基。培養(yǎng)10～14 d觀察細胞集落的生長情況，肉眼可見集落形成時終止培養(yǎng)。大于 50 個細胞的集落計為1個克隆?？寺⌒纬陕?形成克隆細胞數(shù)目/接種細胞數(shù)目×100%。重復(fù)3 次。

1.5 各組細胞凋亡率測算 轉(zhuǎn)染48 h后，洗滌、消化細胞，每組取1×106個細胞離心。用200 μL的Binding Buffer 重懸細胞3次，加入PI染液5 μL，F(xiàn)ITC Annexin-V染液10 μL，混勻，室溫下避光孵育15 min。再加入300 μL的Binding Buffer 緩沖液，1 h內(nèi)上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.6 各組細胞遷移情況觀察 采用Transwell小室實驗。 轉(zhuǎn)染12 h后，細胞撤血清饑餓12～24 h，消化細胞，離心，用含0.2%FBS的原細胞培養(yǎng)液懸浮，調(diào)整細胞密度為1×105/mL。在Transwell小室下層各加入500 μL含10%FBS的原細胞培養(yǎng)液，上室加入250 μL細胞懸液。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，取出小室，用棉簽輕輕擦去小室膜上層細胞。待膜風(fēng)干后，用0.1%的結(jié)晶紫染色15 min，倒置小室，在顯微鏡下觀察膜上細胞數(shù)，200倍鏡下隨機選取5個視野計算穿膜細胞數(shù)。重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染miR-181a模擬物的SiHa細胞增殖、凋亡、遷移情況變化 觀察1組、對照1組、空白1組SiHa細胞miR-181a相對表達量分別為2.4±0.08、1.09±0.04、0.85±0.02，Transwell小室實驗穿膜細胞數(shù)分別為40.60±2.84、58.40±3.56、63.20±2.53，克隆形成實驗克隆形成率分別為20.54%±3.40%、50.99%±1.78%、53.06%±4.91%，細胞凋亡率分別為47.86%±2.04%、36.74%±3.50%、32.15%±2.30%。觀察1組SiHa細胞miR-181a相對表達量、Transwell小室實驗穿膜細胞數(shù)、克隆形成實驗克隆形成率、細胞凋亡率與對照1組、空白1組相比，P均<0.05。

2.2 轉(zhuǎn)染miR-181a抑制物的SiHa細胞增殖、凋亡、遷移情況變化 觀察2組、對照2組、空白2組SiHa細胞miR-181a相對表達量分別為0.09±0.00、0.93±0.02、0.89±0.01，Transwell小室實驗穿膜細胞數(shù)分別為113.80±4.50、67.20±2.10、65.20±2.03，克隆形成實驗克隆形成率分別為69.23%±4.25%、52.71%±1.84%、51.67%±2.25%，細胞凋亡率分別為30.15%±2.51%、32.51%±2.10%、33.05%±2.14%。觀察2組SiHa細胞miR-181a相對表達量、Transwell小室實驗穿膜細胞數(shù)、克隆形成實驗克隆形成率、細胞凋亡率與對照2組、空白2組相比，P均<0.05。

2.3 轉(zhuǎn)染miR-181a模擬物的HeLa細胞增殖、凋亡、遷移情況變化 觀察1組、對照1組、空白1組HeLa細胞miR-181a相對表達量分別為2.31±0.08、0.91±0.02、0.99±0.06，Transwell小室實驗穿膜細胞數(shù)分別為40.00±3.51、56.40±3.56、58.80±2.13，克隆形成實驗克隆形成率分別為36.65%±1.82%、54.77%±3.52%、58.29%±2.56%，細胞凋亡率分別為46.66%±2.80%、23.64%±3.09%、22.10%±4.07%。觀察1組HeLa細胞miR-181a相對表達量、Transwell小室實驗穿膜細胞數(shù)、克隆形成實驗克隆形成率、細胞凋亡率與對照1組、空白1組相比，P均<0.05。

2.4 轉(zhuǎn)染miR-181a抑制物的HeLa細胞增殖、凋亡、遷移情況變化 觀察2組、對照2組、空白2組HeLa細胞miR-181a相對表達量分別為0.02±0.00、0.80±0.02、0.93±0.05，Transwell小室實驗穿膜細胞數(shù)分別為77.60±3.54、57.20±6.20、56.40±2.23，克隆形成實驗克隆形成率分別為79.11%±2.70%、56.82%±1.98%、57.34%±2.12%，細胞凋亡率分別為17.67%±2.30%、20.70%±2.09%、21.30%±3.17%。觀察2組HeLa細胞miR-181a相對表達量、Transwell小室實驗穿膜細胞數(shù)、克隆形成實驗克隆形成率、細胞凋亡率與對照2組、空白2組相比，P均<0.05。

3 討論

據(jù)報道，miRNA約占人類基因總數(shù)的 3%，可能調(diào)控著人體約30%的蛋白質(zhì)編碼基因[9～12]。近年來有關(guān) miRNA在疾病發(fā)生中發(fā)揮的作用及診治應(yīng)用方面的研究較多。miR-181a是較晚被發(fā)現(xiàn)的miRNA之一，但和惡性腫瘤的關(guān)系較為密切。Panda等[13，14]報道m(xù)iR-181a在子宮內(nèi)膜癌中高表達。Zhang等[15]報道m(xù)iR-181a 能通過調(diào)節(jié)腫瘤抑制基因 KLF6 促進胃癌細胞的增殖及轉(zhuǎn)移，在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起著癌基因的作用。Gao等[4]發(fā)現(xiàn)miR-181a低表達與肺癌患者的 TNM 分期、不良預(yù)后關(guān)系密切。Shin 等[5]發(fā)現(xiàn) miR-181a在口腔鱗狀細胞癌細胞中的表達量低于正?？谇唤腔掀ぜ毎? 上調(diào)miR-181a后口腔鱗狀細胞癌細胞的增殖、生長及侵襲、轉(zhuǎn)移能力受到明顯抑制，說明上調(diào)miR-181a 能逆轉(zhuǎn)腫瘤的惡性行為。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-181a模擬物的宮頸癌SiHa和HeLa細胞增殖和遷移能力下降，細胞凋亡水平上升。轉(zhuǎn)染miR-181a抑制物可以達到相反的效果。提示miR-181a在宮頸癌細胞株中起到類似抑癌基因的作用。與上述研究結(jié)果相符。這提示我們miR-181a可能作為抑癌基因參與了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程，miR-181a也可能是宮頸癌診治的新靶點。

目前對miRNA 的研究重點已從序列的發(fā)現(xiàn)鑒定轉(zhuǎn)為對其功能的識別和鑒定。已經(jīng)確定的miR-181a 靶基因有ATM[17]、Bcl-2[18,19]、KRAS[5]和WIF-1[20]等。Luo等[21]研究發(fā)現(xiàn)miR-181a通過抑制GRP78的表達，抑制宮頸癌細胞 HeLa、C-33A、SiHa、HT-4的增殖并增強上述宮頸癌細胞對化療的敏感性。但此研究并未深入探討相關(guān)調(diào)控機制。本課題組將繼續(xù)對miR-181a的目的基因及相互調(diào)控的信號通路展開進一步研究。此機制有望為宮頸癌的靶向治療提供基礎(chǔ)實驗依據(jù)。

參考文獻：

[1] Torre LA, Bray F, Siegel RL, et al. Global cancer statistics, 2012[J]. CA Cancer J Clin,2015,65(2):87-108.

[2] Amiel J, de Pontual L, Henrion-Caude A. miRNA, development and disease[J]. Adv Genet, 2012,80(3):1-36.

[3] Baranwal S, Alahari SK. miRNA control of tumor cell invasion and metastasis[J]. Int J Cancer, 2010,126(6):1283-1290.

[4] Gao W, Yu Y, Cao H, et al. Deregulated expression of miR-21, miR-143 and miR-181a in non small cell lung cancer is related to clinicopathologic characteristics or patient prognosis[J]. Biomed Pharmacother, 2010,64(6):399-408.

[5] Shin KH, Bae SD, Hong HS, et al. miR-181a shows tumor suppressive effect against oral squamous cell carcinoma cells by downregulating K-ras[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2011,404(4):896-902.

[6] Pekarsky Y, Santanam U, Cimmino A, et al. Tcl1 expression in chronic lymphocytic leukemia is regulated by miR-29 and miR-181[J]. Cancer Res, 2006,66(24):11590-11593.

[7] Ciafre S A, Galardi S, Mangiola A, et al. Extensive modulation of a set of microRNAs in primary glioblastoma[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2005,334(4):1351-1358.

[8] Wang Y, Yu Y, Tsuyada A, et al. Transforming growth factor-beta regulates the sphere-initiating stem cell-like feature in breast cancer through miRNA-181 and ATM[J]. Oncogene, 2011,30(12):1470-1480.

[9] 張康, 梅倩, 李祥, 等. 上調(diào)miR-181a和miR-181b表達對HeLa細胞生物學(xué)特性的影響[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2012,20(9):1755-1758.

[10] Ke G, Liang L, Yang JM, et al. MiR-181a confers resistance of cervical cancer to radiation therapy through targeting the pro-apoptotic PRKCD gene[J]. Oncogene, 2013,32(25):3019-3027.

[11] Chen Y, Ke G, Han D, et al. MicroRNA-181a enhances the chemoresistance of human cervical squamous cell carcinoma to cisplatin by targeting PRKCD[J]. Exp Cell Res, 2014,320(1):12-20.

[12] Sassen S, Miska EA, Caldas C. MicroRNA: implications for cancer[J]. Virchows Arch, 2008,452(1):1-10.

[13] Panda H, Chuang TD, Luo X, et al. Endometrial miR-181a and miR-98 expression is altered during transition from normal into cancerous state and target PGR, PGRMC1, CYP19A1, DDX3X, and TIMP3[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2012,97(7):1316-1326.

[14] Yang CC, Hung PS, Wang PW, et al. miR-181 as a putative biomarker for lymph-node metastasis of oral squamous cell carcinoma[J]. J Oral Pathol Med, 2011,40(5):397-404.

[15] Zhang X, Nie Y, Li X, et al. MicroRNA-181a Functions as an Oncomir in Gastric Cancer by Targeting the Tumour Suppressor Gene ATM[J]. Pathol Oncol Res, 2014,20(2):381-389.

[16] Shi L, Cheng Z, Zhang J, et al. hsa-mir-181a and hsa-mir-181b function as tumor suppressors in human glioma cells[J]. Brain Res, 2008，12(36):185-193.

[17] Zhang X, Nie Y, Li X, et al. MicroRNA-181a Functions as an Oncomir in Gastric Cancer by Targeting the Tumour Suppressor Gene ATM[J]. Pathol Oncol Res, 2014,20(2):381-389.

[18] Li H, Hui L, Xu W. miR-181a sensitizes a multidrug-resistant leukemia cell line K562/A02 to daunorubicin by targeting BCL-2[J]. Acta Biochim Biophys Sin, 2012,44(3):269-277.

[19] Bai H, Cao Z, Deng C, et al. miR-181a sensitizes resistant leukaemia HL-60/Ara-C cells to Ara-C by inducing apoptosis[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2012,138(4):595-602.

[20] Ji D, Chen Z, Li M, et al. MicroRNA-181a promotes tumor growth and liver metastasis in colorectal cancer by targeting the tumor suppressor WIF-1[J]. Mol Cancer, 2014,13(4):86.

[21] Luo C, Qiu J. miR-181a Inhibits Cervical Cancer Development via Downregulating GRP78[J]. Oncol Res, 2017,25(8):1341-1348.