劉克鋒，許海江，曹雨晴，劉宇，趙杰

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，鄭州450052)

他克莫司(FK506)是一種從土壤微生物肉湯培養(yǎng)基中分離提純得到的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)免疫抑制劑，屬于鈣調(diào)磷酸酶抑制劑[1,2]，治療器官移植術(shù)后產(chǎn)生的免疫排斥具有顯著療效。由于他克莫司治療窗狹窄，個(gè)體間藥代動(dòng)力學(xué)差異大，故需要進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)[3,4]。CYP2D6是一種重要的P450系氧化代謝酶，參與多種藥物的代謝過(guò)程，其基因多態(tài)性對(duì)藥物的代謝有明顯影響[5～7]，CYP2D6基因單核苷酸多態(tài)性有可能影響他克莫司在體內(nèi)的代謝。本研究觀察了漢族腎移植受者CYP2D6基因1065852位點(diǎn)和16947位點(diǎn)多態(tài)性，以及上述多態(tài)性與他克莫司血藥濃度/劑量(C/D)的相關(guān)性，探討通過(guò)檢測(cè)CYP2D6基因型指導(dǎo)腎移植術(shù)后受者他克莫司用量的可行性?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇 2013年8月～2016年10月在我院進(jìn)行腎移植手術(shù)的患者85例。納入標(biāo)準(zhǔn)：首次進(jìn)行腎移植手術(shù)，依從性好，均口服他克莫司+嗎替麥考酚酯膠囊+醋酸潑尼松三聯(lián)免疫抑制方案，均不使用利福平、紅霉素等顯著影響他克莫司血藥濃度的藥物。排除術(shù)后1個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)嚴(yán)重排斥反應(yīng)或并發(fā)嚴(yán)重感染的腎移植患者。入組患者男62例、女23例，年齡(34.94±10.98)歲，身高(167.22±9.37)cm，體質(zhì)量(59.12±13.63)kg。本研究已獲醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，入組患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 CYP2D6基因rs1065852位點(diǎn)和rs16947位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè) 采集腎移植患者外周靜脈血2～3 mL，按照血液基因組柱式小量提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取患者DNA于-20 ℃保存。采用Sequenom MassArray系統(tǒng)基因分型方法對(duì)患者進(jìn)行CYP2D6基因rs1065852位點(diǎn)和rs16947位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)，所需引物均用AssayDesigner 3.1軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。rs1065852位點(diǎn)上游引物5′-ACGTTGGATGAGTCCACATGCAGCAGGTTG-3′-，下游引物5′-ACGTTGGATGTGGTGGACCTGATGCACCG-3′，退火溫度53.3 ℃；rs16947位點(diǎn)上游引物5′-ACGTTGGATGTGAGAGCAGCTTCAATGATG-3′，下游引物5′-ACGTTGGATGTGGTCGAGGTGGTCACCATC-3′，退火溫度46.6 ℃。PCR反應(yīng)體系共5 μL ，含有雙蒸水1.8 μL、10×PCR緩沖液0.5 μL、25 nmol/L氯化鎂溶液0.4 μL、25 mmol/L dNTP混合液0.1 μL、0.5 μmol/L引物混合液1 μL、5 U/μL的DNA聚合酶0.2 μL，10 ng/μL的DNA 1 μL。反應(yīng)過(guò)程為94 ℃預(yù)變性15 min,94 ℃變性20 s，分別在53.3 ℃、46.6 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)45次，72 ℃最后延伸3 min。

1.3 他克莫司應(yīng)用方法及C/D測(cè)算 患者術(shù)后第2天開(kāi)始服用他克莫司，2次/d，劑量為0.15～0.30 mg/(kg·d)，根據(jù)他克莫司血藥濃度及患者臨床表型及時(shí)調(diào)整劑量，待他克莫司血藥濃度穩(wěn)定后，于患者晨起服藥前取靜脈血2～3 mL放置在EDTA-K2真空管中，用酶聯(lián)免疫吸附法在全自動(dòng)免疫分析儀上測(cè)定他克莫司血藥濃度。他克莫司C/D=他克莫司血藥濃度/他克莫司劑量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。采用HWE檢驗(yàn)基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡。多個(gè)基因型患者他克莫司C/D比較采用Kruskai-Wallis秩和檢驗(yàn)，兩個(gè)基因型患者他克莫司C/D比較采用Mann-Whiteny秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CYP2D6基因rs1065852位點(diǎn)和rs16947位點(diǎn)多態(tài)性分布 85例患者中CYP2D6基因rs1065852位點(diǎn)基因型為GG者27例、GA者39例、AA者16例，等位基因G、A頻數(shù)分別為93(56.71%)、71(43.29%)；rs16947位點(diǎn)基因型為GG者47例、GA者27例、AA者11例，等位基因G、A頻數(shù)分別為121(71.17%)、49%(28.82%)。上述2個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因分布符合Hardy-weinberg平衡(P>0.05)，表明本研究樣本具有良好的代表性。

2.2 不同基因型者他克莫司C/D比較 CYP2D6基因rs1065852位點(diǎn)基因型GG、GA和AA型患者他克莫司C/D值分別為104.48±57.83、143.46±77.49、124.74±80.17，GG型和GA型患者他克莫司C/D值相比，P<0.05。CYP2D6基因rs16947位點(diǎn)基因型GG、GA和AA型患者他克莫司C/D值分別為159.10±121.21、128.49±81.68、108.84±70.19，P>0.05。

3 討論

他克莫司是從土壤真菌的肉湯培養(yǎng)基中提取的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，是一種強(qiáng)效免疫抑制劑[8,9]，廣泛應(yīng)用于器官移植術(shù)后排斥反應(yīng)的預(yù)防和治療。但是由于他克莫司治療窗窄，個(gè)體差異大，故需要進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)。國(guó)內(nèi)外大量研究[10～12]表明CYP3A代謝酶和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體P-糖蛋白與他克莫司血藥濃度有相關(guān)性，但是關(guān)于CYP2D6代謝酶對(duì)他克莫司血藥濃度影響的研究較少。雖然CYP2D6代謝酶在肝臟中的含量只占肝臟總量的2%，但是卻參與了25%以上的藥物的代謝活動(dòng)，并且CYP2D6是細(xì)胞色素P450基因家族中惟一不能被誘導(dǎo)的酶，而該酶的基因多態(tài)性對(duì)酶的代謝和功能有重要影響[9]。故本研究探討了CYP2D6基因單核苷酸多態(tài)性對(duì)腎移植術(shù)后患者他克莫司C/D的影響。

目前國(guó)內(nèi)關(guān)于CYP2D6基因多態(tài)性對(duì)腎移植術(shù)后患者他克莫司代謝影響的研究?jī)H有兩篇文獻(xiàn)報(bào)道。周逸雯等[10]認(rèn)為CYP2D6基因多態(tài)性與他克莫司代謝并無(wú)明顯的相關(guān)性，而Pokhrel等[11]研究結(jié)果顯示CYP2D6基因單核苷酸多態(tài)性與他克莫司代謝相關(guān)，野生型和突變雜合子與突變純合子相比較，需要更高劑量的他克莫司才能達(dá)到相同的抗排斥效果。本研究中rs1065852位點(diǎn)基因型為GG型者有27例、GA型者39例、AA型者16例，GA型與GG型患者他克莫司C/D有顯著性差異，若要達(dá)到相同的他克莫司血藥濃度，GG型腎移植患者需要更高的劑量。rs16947位點(diǎn)基因型為GG型者47例、GA型者27例、AA型者11例，3型患者他克莫司C/D無(wú)顯著性差異，也就是說(shuō)rs16947位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性對(duì)腎移植術(shù)后患者他克莫司血藥濃度并沒(méi)有影響。

綜上所述，盡管CYP2D6基因rs1065852位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與腎移植術(shù)后受者他克莫司C/D有一定相關(guān)性，但是仍然需要綜合考慮多種因素的影響。研究CYP2D6基因多態(tài)性與腎移植術(shù)后受者他克莫司C/D的關(guān)系還需要長(zhǎng)期和大樣本量的研究。無(wú)論如何，腎移植受者服用他克莫司前檢測(cè)CYP2D6基因rs1065852位點(diǎn)多態(tài)性都有助于個(gè)體化給藥，提高臨床療效和減少不良反應(yīng)的發(fā)生。

參考文獻(xiàn)：

[1] Strset E, Holford N, Hennig S, et al. Improved prediction of, tacrolimus concentrations, early after kidney, transplantation using, theory-based, pharmacokinetic modelling[J]. Br J Clin Pharmacol, 2014, 78(3):509-523.

[2] Chen D, Guo F, Shi J, et al. Association of hemoglobin levels, CYP3A5, and NR1I3 gene polymorphisms with tacrolimus pharmacokinetics in liver transplant patients.[J]. Drug Metab Pharmacokinet, 2014, 29(3):249-253.

[3] 張?jiān)蔓? 明英姿, 周宏灝,等. 他克莫司:藥代動(dòng)力學(xué),藥效動(dòng)力學(xué)和藥物基因組學(xué)[J]. 中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué), 2014, 19(9):1042-1050.

[4] Tamashiro EY, Felipe CR, Fdv G, et al. Influence of CYP3A4 and CYP3A5 polymorphisms on tacrolimus and sirolimus exposure in stable kidney transplant recipients[J]. Drug Metab PersonTher, 2017, 32(2):89.

[5] Chand S, Mcknight AJ, Borrows R. Genetic polymorphisms and kidney transplant outcomes[J]. Curr Opinion Nephrol Hyperten, 2014, 23(6):605-610.

[6] 李芹, 王睿. 細(xì)胞色素P4502D6基因多態(tài)性和藥物相互作用[J]. 中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué), 2006, 11(4):369-374.

[7] 楊棟, 萬(wàn)立華, 涂政,等. 中國(guó)漢族人群CYP2D6、CYP3A4 SNP位點(diǎn)基因多態(tài)性分析[J]. 重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 38(5):687-690.

[8] Zeng L, Chen Y, Wang Y, et al. MicroRNA Hsa-miR-370-3p Suppresses the Expression and Induction of CYP2D6 by Facilitating mRNA Degradation[J]. Biochem Pharmacol, 2017(140):139-140.

[9] Albuquerque J, Ribeiro C, Naranjo MEG, et al. Characterization of CYP2D6 genotypes and metabolic profiles in the Portuguese population: Pharmacogenetic implications[J]. Personal Med, 2013, 10(7):709-718

[10] Laskow DA, Rd NJ, Shapiro RS, et al. The role of tacrolimus in adult kidney transplantation: a review[J]. Clin Transplant, 1998, 12(6):489-503.

[11] 劉曉曼, 李嘉麗, 王洪陽(yáng),等. SUMO4基因多態(tài)性與腎移植患者他克莫司濃度相關(guān)性的研究[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2017(5):760-765.

[12] 王志宏, 劉蕾. 他克莫司的藥物相互作用研究進(jìn)展[J]. 臨床合理用藥雜志, 2011, 13(25):430-434.

[13] Kuypers DR, De LH, Naesens M, et al. Combined effects of CYP3A5*1, POR*28, and CYP3A4*22 single nucleotide polymorphisms on early concentration-controlled tacrolimus exposure in de-novo renal recipients[J]. Pharmacog Genom, 2014, 24(12):597.

[14] Aouam K, Kolsi A, Kerkeni E, et al. Influence of combined CYP3A4 and CYP3A5 single-nucleotide polymorphisms on tacrolimus exposure in kidney transplant recipients: a study according to the post-transplant phase[J]. Pharmacogenomics, 2015,16(18):2045-2054.

[15] 侯明明, 宋洪濤, 王慶華,等. 腎移植患者CYP3A5*3基因多態(tài)性對(duì)他克莫司血藥濃度/劑量比和療效的影響[J]. 中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志, 2010, 30(4):313-316.

[16] 韓璐, 劉潔. CYP2D6基因多態(tài)性及對(duì)藥物代謝的影響[J]. 中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué), 2011, 16(1):105-110.

[17] Yan FU, Fan CH, Deng HH, et al. Association of CYP2D6 and CYP1A2 gene polymorphism with tardive dyskinesia in Chinese schizophrenic patients[J]. Acta Pharmacol Sin, 2006, 27(3):328-332

[18] Yang Y, Botton MR, Scott ER, et al. Sequencing the CYP2D6 gene: from variant allele discovery to clinical pharmacogenetic testing.[J]. Pharmacogenomics, 2017, 18(7):673-685.

[19] 周逸雯, 周琰, 吳炯,等. CYP3A4、CYP3A5和CYP2D6基因單核苷酸多態(tài)性對(duì)腎移植術(shù)后穩(wěn)定期患者他克莫司代謝的影響[J]. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué), 2015, 30(11):1091-1095.

[20] Gaurab Pokhrel. 細(xì)胞色素CYP(450)3A4、3A5和2D6基因單核苷酸多態(tài)性對(duì)腎移植患者他克莫司代謝的影響[D]. 復(fù)旦大學(xué), 2014.