董軍何燕飛孫紅祥

1 浙江省紹興市中醫(yī)院 浙江 紹興 312000

2 浙江大學(xué) 浙江 杭州 310058

桑龍平喘合劑系由桑白皮、地龍、炙麻黃、杏仁、炒蘇子、葶藶子、炙冬花、射干、魚(yú)腥草、金蕎麥、全蝎、當(dāng)歸和甘草組成。本研究應(yīng)用高效液相色譜法（HPLC）建立同時(shí)測(cè)定桑龍平喘合劑中蘆丁和綠原酸含量的方法，為其質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試劑

Waters 600高效液相色譜儀，Waters 2996 PDA檢測(cè)器，Empower色譜工作站（美國(guó)Waters公司）；色譜柱為Diamond C18鍵合硅膠柱（5mm×250mm，5μm）；Sartorious型電子分析天平（德國(guó)W-Germany）；超純水儀（德國(guó)曼默博爾公司）。甲醇（分析純），乙腈（色譜純），磷酸（分析純），均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水為超純水，使用前以微孔濾膜過(guò)濾。綠原酸對(duì)照品（110753-201415，含量98%）和蘆丁（100080-201610，含量測(cè)定用）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。桑白皮（140901）、地龍（150406）、炙麻黃（150302）、杏仁（150312）、炒蘇子（150115）、葶藶子（150208）、炙冬花（150301）、射干（141213）、魚(yú)腥草（150327）、金蕎麥（150308）、全蝎（150126）、當(dāng)歸（150213）和甘草（140917）由紹興市中醫(yī)院提供，經(jīng)紹興市食品藥品檢驗(yàn)中心專(zhuān)家鑒定符合2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》（簡(jiǎn)稱(chēng)《藥典》）標(biāo)準(zhǔn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件：色譜柱：Diamond C18（5mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B）；梯度洗脫0～5min5%A，5～10min12%A，10～25min15%A，25～45min 28%A，45～50min 100%A，50～50min 5%A；檢測(cè)波長(zhǎng)：324nm（綠原酸）和254nm（蘆?。?；流速：1.0ml/min；進(jìn)樣量：10μl；柱溫：35℃。

2.2 對(duì)照品溶液制備：精密稱(chēng)取綠原酸對(duì)照品16.2mg和蘆丁對(duì)照品15.0mg，置于10ml容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液（綠原酸和蘆丁的濃度分別為1.62和1.50mg/ml）。分別精密量取綠原酸和蘆丁儲(chǔ)備液各2.5ml，置于10ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液及陰性對(duì)照溶液制備：按處方分別稱(chēng)取藥材（合計(jì)110g），分別以10倍和8倍量水煎煮1.5h和1.0h。煎煮液紗布濾過(guò)，濾液減壓濃縮至110ml，加入2倍量的95%乙醇，靜置過(guò)夜，濾過(guò)，濾液減壓回收乙醇濃縮至55ml，得桑龍平喘湯合劑，生藥濃度為2.0g/ml。取3個(gè)批次桑龍平喘湯合劑各1份，每份2.0ml，分別置于10.0ml容量瓶，甲醇稀釋并定容至刻度，以0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，即得供試品溶液。缺綠原酸陰性對(duì)照組方藥為金蕎麥、地龍、炒蘇子、葶藶子、炙麻黃、射干、杏仁、生甘草、全蝎；缺蘆丁陰性對(duì)照組方藥為地龍、炒蘇子、葶藶子、炙麻黃、射干、杏仁、全蝎，陰性對(duì)照溶液制備方法與供試品溶液相同。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：分別精密吸取桑龍平喘湯供試品溶液、綠原酸對(duì)照品溶液、蘆丁對(duì)照品溶液、混合對(duì)照品溶液、缺綠原酸陰性對(duì)照溶液和缺蘆丁陰性對(duì)照溶液各10μl，按“2.1”項(xiàng)色譜條件分別測(cè)定。綠原酸和蘆丁的理論塔板數(shù)分別為7108和3467，兩者均大于3000，即綠原酸和蘆丁均達(dá)到基線分離。陰性對(duì)照溶液在與對(duì)照品相對(duì)應(yīng)的色譜峰位處無(wú)干擾峰出現(xiàn)。結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.5 線性關(guān)系考察：分別精密量取混合對(duì)照品溶液1.0、3.0、5.0、10.0、20.0ml于25.0ml量瓶，加甲醇至刻度，搖勻。按“2.1”項(xiàng)色譜條件分別精密吸取10μl進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰面積，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品溶液濃度（X）為橫坐標(biāo)作線性回歸，得綠原酸和蘆丁峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得回歸方程見(jiàn)表1。結(jié)果表明綠原酸、蘆丁在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。綠原酸濃度25.3μg/ml時(shí)S/N值為43.7，蘆丁濃度23.4μg/ml時(shí)S/N值為61.8，均大于10，滿足定量要求。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取“2.3”項(xiàng)的供試品溶液10μl，分別于0、4、6、8、12和24h測(cè)定，綠原酸和蘆丁峰面積RSD值分別為1.85和1.43，說(shuō)明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

圖1 桑龍平喘湯高效液相色譜圖

表1 綠原酸和蘆丁的回歸曲線

2.7 儀器精密度試驗(yàn)：精密吸取“2.2”項(xiàng)混合對(duì)照品溶液10μl，按“2.1”項(xiàng)色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，峰面積積分值基本一致，綠原酸和蘆丁峰面積RSD值分別為0.57%和0.69%。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)：分別取同一批次桑龍平喘湯合劑，按“2.3”項(xiàng)方法平行制備6份供試品溶液，并按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積計(jì)，RSD分別為1.79和1.28，表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)：精密吸取已測(cè)得含量的桑龍平喘湯合劑樣品9份，每份0.2ml，置于1.0ml量瓶中，分別加入綠原酸對(duì)照品溶液（810.0μg/ml）和蘆丁對(duì)照品溶液（375.0μg/ml）各50、100、150μl，以甲醇稀釋并定容至刻度。按“2.3”項(xiàng)方法制備樣品溶液，并按“2.1”項(xiàng)色譜條件分別測(cè)定，計(jì)算回收率。見(jiàn)表2。

2.10 樣品含量測(cè)定：取3批桑龍平喘合劑樣品，按“2.3”項(xiàng)方法制備樣品，精密吸取混合對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，按上述含量測(cè)定方法測(cè)定，計(jì)算樣品中綠原酸和蘆丁含量。見(jiàn)表3。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

表3 含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討論

根據(jù)2015年版《藥典》，綠原酸和蘆丁的含量可在340nm處同時(shí)測(cè)定。然而，本實(shí)驗(yàn)分別提取綠原酸和蘆丁在340nm波長(zhǎng)和最大吸收波長(zhǎng)的峰面積進(jìn)行線性回歸，發(fā)現(xiàn)在340nm處提取的色譜圖峰面積的相關(guān)系數(shù)比最大吸收波長(zhǎng)處小，尤其是蘆丁的線性關(guān)系較差。因此，采用二極管陣列檢測(cè)器（DAD）程序可變波長(zhǎng)法，使綠原酸和蘆丁分別在各自的最大吸收波長(zhǎng)處進(jìn)行檢測(cè)。因桑龍平喘湯成分復(fù)雜，各成分之間極性差別較大，采用等度洗脫無(wú)法實(shí)現(xiàn)各個(gè)色譜峰較好的分離。故本實(shí)驗(yàn)采用線性梯度洗脫的方法。通過(guò)考察乙腈-水梯度變化對(duì)出峰的影響，以及不同濃度磷酸水溶液對(duì)峰型、分離度的影響，最終確定乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0～5min5%A，5～10min12%A，10～25min15%A，25～45min 28%A，45～50min 100%A，50～50min 5%A）。此時(shí)，綠原酸、蘆丁能與其他組分達(dá)到基線分離，峰型對(duì)稱(chēng)。本實(shí)驗(yàn)所建立的HPLC法能對(duì)桑龍平喘湯中綠原酸和蘆丁進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，可用于桑龍平喘湯的質(zhì)量控制。