王翠艷，王志偉

1.濮陽市人民醫(yī)院消化一科，河南 濮陽 457000； 2.鄭州大學第一附屬醫(yī)院腔內血管外科

胃癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其5年生存率較低。近年來，隨著人們生活方式的改變、人口老齡化的加快、空氣污染的加劇等，胃癌的發(fā)病率逐漸上升。研究[1-2]表明，胃癌的死亡率占腫瘤死亡的第2位，嚴重危害人類的生命安全。據統(tǒng)計，2017年美國胃癌的新增病例約2.8萬，新增死亡人數(shù)約1萬，占腫瘤發(fā)病率和死亡率的第1位和第2位[3]。研究統(tǒng)計表明，2015年中國胃癌新增病例約73萬，新增死亡人數(shù)約61萬[4]。目前胃癌的主要治療方法是手術結合放化療，但因胃癌早期癥狀不明顯以及缺乏早期診斷的標志物，大部分的胃癌患者發(fā)現(xiàn)時已是晚期，導致胃癌患者預后差，5年生存率低。大量的研究[5-6]表明，癌癥的發(fā)生、發(fā)展受多種因素的影響，例如基因的突變、缺失、表達失調均可引起細胞惡性增殖、侵襲、遷移紊亂等。因此，尋找新的生物學靶基因位點成為目前研究的熱點之一。ANK2是一種細胞支架蛋白，屬于錨蛋白家族(Ankyrins, ANKs)的成員之一，廣泛表達于機體的各個組織。近年來的研究[7]證實，錨蛋白家族參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。但ANK2在胃癌中的研究較少，因此本研究通過siRNA特異性沉默ANK2基因表達，觀察其表達量降低對胃癌SGC-7901細胞的增殖、侵襲、細胞周期的影響，為胃癌診斷治療以及分子機制的研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1實驗材料人胃癌細胞系SGC-7901購自中科院細胞庫，胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，CCK-8細胞增殖檢測試劑盒、脂質體Lipofectamine 2000、周期檢測試劑盒、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒、流式細胞儀、Matrigel膠均購自美國BD公司，細胞培養(yǎng)板、Transwell小室均購自美國Corning公司，ANK2抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗體購自美國Sigma公司，辣根過氧化物酶標記的二抗購自北京聯(lián)科生物公司，低溫離心機購自德國Eppendorf公司，酶標儀購自瑞士Tecan公司。

1.2方法

1.2.1 細胞的培養(yǎng)：采用質量濃度為750 g/L的酒精提前處理實驗試劑和耗材，超凈工作臺紫外燈照射30 min；將凍存與液氮中的SGC-7901細胞系快速放入37 ℃水浴箱中，搖勻，采用3 ml滴管吹勻細胞，加入8 ml RPMI-1640培養(yǎng)基，采用質量濃度為100 g/L的胎牛血清和雙抗，混勻離心，棄上清，加入5 ml完全培養(yǎng)基重懸細胞，在體積分數(shù)為5%的CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞融合度70%～80%時，采用質量濃度為2.5 g/L胰酶消化細胞，加入新鮮培養(yǎng)基制成單細胞懸液后置于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

1.2.2 細胞的轉染：以新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細胞并將細胞密度調整為6×105ml-1，然后接種在6孔板上，常規(guī)條件下培養(yǎng)。細胞融合度90%～95%時進行轉染。實驗分為3組：對照組、無義組、siRNA-ANK2組。轉染前2 h，更換為無胎牛血清的培養(yǎng)基，將4 μg siRNA ANK2或siRNA 無義序列與250 μl OPTI-MEM培養(yǎng)基混合均勻，10 μl Lipofectamine 2000與250 μl OPTI-MEM培養(yǎng)基混勻，將稀釋的DNA混合液加入到Lipofectamine 2000混合液中，室溫靜置20 min，然后將混合液轉移至6孔板中，混勻，轉染4～6 h，將培養(yǎng)基更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細胞。

1.2.3 轉染后細胞中ANK2蛋白表達量的檢測：采用蛋白質印跡法(Western blotting)檢測轉染后細胞中ANK2蛋白表達量。PBS洗滌各組細胞2遍，吸取500 μl RIPA裂解液，冰上放置10 min，將細胞完全粉碎，離心，取上清。BCA法測定樣品蛋白濃度，玻璃板清洗干凈，配置質量濃度為100 g/L的分離膠和50 g/L的濃縮膠，置于蛋白電泳槽中，加入適量電泳液。取蛋白質樣品與5×蛋白上樣緩沖液混合，沸水浴10 min，然后迅速冰浴10 min，每個上樣孔加入40 μg蛋白樣品，調整電壓至80 V進行電泳，至藍色條帶到達凝膠底部0.5 cm處，調整電壓至100 V，藍色條帶移動至凝膠底部，停止電泳。去除濃縮膠，將攜帶目的蛋白的凝膠置于電轉液中浸泡20 min，將蛋白質轉移至硝酸纖維素膜上，正面進行標記，放入5%封閉液中，搖床上封閉60 min。TBS-T洗膜10 min，置于一抗溶液中，4 ℃過夜。TBS-T洗膜5次×5 min，放入辣根過氧化物酶標記的二抗溶液中，混合均勻，室溫孵育1 h，TBS-T洗膜5次×5 min，加入ECL的A、B液反應1 min，暗盒中曝光，成像儀中成像，分析蛋白質光密度值。

1.2.4 細胞活性的檢測：常規(guī)消化各組細胞，以2×103/孔細胞接種于96孔板上，放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每孔細胞中加入10 μl CCK-8溶液，培養(yǎng)箱中孵育1 h，酶標儀上450 nm波長測定細胞的吸光度(OD值)。

1.2.5 細胞周期的檢測：常規(guī)消化各組細胞，加入PBS重懸細胞，調整細胞濃度為2×106ml-1，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入質量濃度為700 g/L的乙醇(提前預冷)固定12 h，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用PBS緩沖液清洗細胞，加入500 μl PI(含RNA酶)，避光，4 ℃孵育0.5 h，置于流式細胞儀檢測激發(fā)波長488 nm細胞各周期DNA含量。

1.2.6 細胞侵襲能力的檢測：提前將Matrigel膠、培養(yǎng)基、Transwell小室置于4 ℃冰箱中，加入RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋Matrigel膠至4 g/L，吸取70 μl Matrigel膠加入Transwell小室上室底部，搖勻，置于37 ℃恒溫箱中通風30 min，使Matrigel膠充分凝固。吸取無血清的培養(yǎng)基加入Transwell小室中。胰酶消化已饑餓24 h的細胞，將細胞濃度調整為5×105ml-1。取200 μl細胞稀釋液接種于Transwell小室上室中，下室中加入700 μl質量濃度為100 g/L胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基，置于24孔板上，在體積分數(shù)為5%的CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，甲醛固定30 min，結晶紫染色30 min，無菌PBS緩沖液清洗3次，隨機選取5個視野拍照計數(shù)，每組5個復孔，實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1轉染后細胞中ANK2蛋白的表達量Western blotting檢測轉染siRNA ANK2或siRNA 無義序列后胃癌SGC-7901細胞中ANK2蛋白的表達情況，結果如表1、圖1所示，與對照組相比，siRNA-ANK2組ANK2蛋白水平顯著下調，差異具有統(tǒng)計學意義(t=5.219,P<0.05)。

圖1 轉染后細胞中ANK2蛋白的表達量Fig 1 The expression of ANK2 protein in transfected cells

組別ANK2/GAPDH對照組0.386±0.045無義組0.367±0.043siRNA-ANK2組0.216±0.030*F值16.358P值0.004

注：與對照組相比，*P<0.05。

2.2沉默ANK2表達對胃癌細胞增殖情況的影響CCK-8法檢測轉染siRNA ANK2或siRNA無義序列后胃癌SGC-7901細胞增殖情況的變化。如表2所示，與對照組相比，無義組細胞的OD值無顯著變化，siRNA-ANK2組細胞的OD值顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(t=4.811,P<0.05)。

2.3沉默ANK2表達對胃癌細胞周期的影響流式

細胞術檢測轉染siRNA ANK2或siRNA無義序列后胃癌SGC-7901細胞周期的變化。如表3所示，與對照組相比，無義組細胞周期無明顯變化，siRNA-ANK2組細胞周期G0/G1期比例顯著升高(t= 3.008,P<0.05)，S期顯著降低(t=4.016 ,P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義。

表2 沉默ANK2表達對胃癌細胞增殖情況的影響

注：與對照組相比，*P<0.05。

表3 沉默ANK2表達對胃癌細胞周期的影響Tab 3 Effect of silencing ANK2 expression on cell cycle of gastric cancer(±s) %

注：與對照組相比，*P<0.05。

2.4沉默ANK2表達對胃癌細胞侵襲能力的影響Transwell法檢測轉染siRNA ANK2或siRNA無義序列后胃癌SGC-7901細胞侵襲能力的變化。如表4所示，與對照組相比，無義組細胞的侵襲數(shù)無顯著變化，siRNA-ANK2組細胞的侵襲數(shù)顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(t=9.813,P<0.05)。

表4 沉默ANK2表達對胃癌細胞侵襲能力的影響Tab 4 Effect of silencing ANK2 expression on invasion ability of

注：與對照組相比，*P<0.05。

3 討論

近年來，癌癥已成為嚴重威脅人類健康的疾病之一，發(fā)病率逐年升高。腫瘤的發(fā)生主要是由于機體受到某種因素的刺激導致原癌基因和抑癌基因表達量失衡。目前,臨床上常采用手術治療聯(lián)合放射、化學療法，但無法根除或徹底殺滅腫瘤細胞，腫瘤患者常出現(xiàn)復發(fā)和轉移，預后差，且常規(guī)化療特異性較差，不僅殺傷腫瘤細胞，而且損害機體正常的細胞，具有較大的不良反應[8]?；蛑委熓且环N安全、有效、不良反應小的治療方法，成為腫瘤生物治療研究的重點。RNA干擾技術是一種高效、特異性高、作用范圍廣、操作簡單的基因抑制技術，主要通過導入特異性雙鏈RNA，引起靶基因特定的沉默應答反應，從而抑制靶基因的表達，目前多用于基因治療和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中相關基因功能的探索[9-10]。在本實驗中，通過siRNA技術特異性降低ANK2在胃癌細胞中的表達，結果顯示，胃癌細胞SGC-7901轉染siRNA ANK2后，細胞中ANK2蛋白的表達量明顯降低。

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，研究表明，機體內抑癌基因和癌基因的平衡與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關[11-12]，但目前對胃癌的生長和轉移機制尚不完全清楚，因此，研究其生長、轉移的關鍵因子，對胃癌的診斷和治療具有重要意義。腫瘤的惡性生長、侵襲、遷移是導致腫瘤預后較差、死亡率增加的主要原因[13-14]。ANK2編碼的Ankyrin-B屬于ANKs家族，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關[15]。研究[7,16-17]發(fā)現(xiàn)，ANKs在前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌組織中的表達量高于癌旁組織，并調節(jié)腫瘤細胞的增殖、轉移能力以及膜轉運過程。在本實驗中，CCK-8檢測細胞的增殖活性，實驗結果顯示，當胃癌細胞SGC-7901中ANK2表達量下降時，細胞的增殖活性明顯降低；流式細胞術檢測細胞周期結果發(fā)現(xiàn)，ANK2表達量下調時，G0/G1期的細胞比例明顯增多，S期的細胞比例降低，表明沉默ANK2基因表達能使人胃癌細胞SGC-7901的細胞周期阻滯在G0/G1期，抑制其向S期轉化；Transwell實驗結果表明，ANK2基因沉默的SGC-7901細胞的侵襲能力明顯降低。研究[18]表明，干擾ANK2基因的表達可有效抑制胰腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移，與本實驗結果相符。

綜上所述，沉默胃癌細胞SGC-7901中ANK2表達，可以降低胃癌細胞增殖活性，抑制胃癌細胞生長，使細胞周期阻滯在G0/G1期，阻礙胃癌細胞的轉移能力，ANK2可能成為胃癌基因治療的潛在靶點。

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