鮑內(nèi)臟蛋白肽抗氧化和免疫調(diào)節(jié)活性

何傳波，邵 杰，魏好程，熊何健，吳國宏，馬 英*，吳建勇

（1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021；3.香港理工大學(xué)應(yīng)用生物與化學(xué)科技學(xué)系，香港 999077）

鮑屬于單殼海洋貝類，腹足綱，前鰓亞綱，原始腹足目，鮑科。自古以來鮑就是我國的名貴食材，因其肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，享有“海味之冠”的美譽，深受人們的喜愛[1]。據(jù)統(tǒng)計，2014年，我國鮑年產(chǎn)量達12萬 t左右，總產(chǎn)值達142.3億 元，其中，福建省鮑養(yǎng)殖量占全國的75%以上，位居第一[2]。目前，市場上經(jīng)過加工的鮑產(chǎn)品主要有速凍鮑、罐頭鮑、干制鮑、鮑調(diào)味品和鮑營養(yǎng)保健品[3]。然而，在鮑加工過程中會產(chǎn)生大量的鮑內(nèi)臟，這些內(nèi)臟占鮑質(zhì)量的25%以上，而鮑內(nèi)臟中含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖、脂肪酸等營養(yǎng)成分和對人身體有益的生物活性物質(zhì)[4-6]，直接廢棄既浪費資源又污染環(huán)境。

由于海洋生物生存的環(huán)境與陸地生物完全不同，如高壓、低溫、高溫和高鹽等，為適應(yīng)這些極端的海洋環(huán)境，海洋生物蛋白質(zhì)無論氨基酸的組成還是氨基酸的序列都與陸地生物蛋白有很大的不同，因此海洋生物是新型活性肽的豐富來源[7]。大量文獻報道證實，海洋生物活性肽具有抗菌、抗腫瘤、降血壓、抗氧化、降血脂、降血糖等諸多生理功能[8-11]。然而，天然存在的活性肽大部分含量微少，又難提取，不足以大量生產(chǎn)供給所需，因此，近年來人們更多地把目光投向開發(fā)蛋白酶解產(chǎn)物獲得海洋活性肽這條途徑上來。低值魚類、水產(chǎn)加工下腳料是我國的大宗低值蛋白質(zhì)資源，是獲取活性肽的首選原料，其高值化綜合利用已成為我國水產(chǎn)高技術(shù)發(fā)展的重要研究內(nèi)容。

本研究以福建養(yǎng)殖的皺紋盤鮑（Haliotis discus hannai Ino）內(nèi)臟為原料，利用堿性蛋白酶酶解和超濾技術(shù)聯(lián)合制備鮑內(nèi)臟蛋白肽（abalone visceral protein peptide，AVPP），對其抗氧化和免疫調(diào)節(jié)活性進行探討，以期為鮑內(nèi)臟功能性食品的開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。同時，實驗結(jié)果對促進海洋動物源蛋白資源的高值化開發(fā)利用、減少環(huán)境污染、延長鮑加工產(chǎn)業(yè)鏈具有積極意義。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

冷凍皺紋盤鮑內(nèi)臟由廈門島之源生物科技有限公司提供，凍干、粉碎后于-18 ℃貯藏備用。

SPF級雄性KM小鼠、SPF級雄性BALB/c小鼠，體質(zhì)量（18±2）g，均購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，許可證號SCXK（滬）2012-0002。分籠飼養(yǎng)，每天光照12 h，動物房環(huán)境溫度20～25 ℃，相對濕度50%～60%，自由進食進水，每天更換飼料、飲水和墊料，進行7 d適應(yīng)性喂養(yǎng)。小鼠維持飼料，A級，合格證號：SCXK（京）2014-0010，購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司。

堿性蛋白酶（1.53×105U/g） 諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；二苯基苦味酰基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、細(xì)胞色素c、抑肽酶、生長抑制素、氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）、還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH），均為色譜純 美國Sigma公司；羥自由基試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、谷胱甘肽試劑盒、丙二醛（malonaldehyde，MDA）試劑盒、蛋白質(zhì)羰基試劑盒 南京建成生物工程研究所；綿羊血紅細(xì)胞（sheep red-blood cell，SRBC） 南京森貝伽生物科技有限公司；印度墨汁 廈門鷺隆生物科技有限公司；其余化學(xué)試劑均為分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JDG-0.2T真空凍干機 蘭州科近真空凍干技術(shù)有限公司；RNF0460-011 多功能卷式膜小試設(shè)備 廈門福美科技有限公司；XLY2-23-0.75酶解罐 國貿(mào)集團；TDL-5離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；UV-8000A紫外-可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；BS-124S電子天平、M35電子水分測定儀 德國賽多利斯股份有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；pH211臺式酸度測定儀 北京哈納科技有限公司；Ultimate3000高效液相色譜儀 美國DIONEX公司；MSI微型漩渦振蕩器 廣州科技實驗室技術(shù)有限公司；SX2-10-13馬弗爐 上海石研電爐有限公司；SHA-B水浴恒溫振蕩器 金壇市國旺儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 AVPP的制備

取鮑內(nèi)臟原料粉1 kg，按照料液比1∶50（m/V）加入50 L的水混合于100 L的酶解罐中，先用堿性蛋白酶酶解，酶解完成后95 ℃滅酶、冷卻，酶解液過200 nm的微濾膜除雜，取一部分直接凍干即為鮑內(nèi)臟酶解粗產(chǎn)物（abalone viscera crude extracts，AVCE）；余下的酶解液過10 kDa的超濾膜，收集透過液凍干后即為AVPP樣品。

1.3.2 理化指標(biāo)的檢測

多糖含量測定采用苯酚硫酸法[12]；粗蛋白含量測定參照GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》；水分含量測定參照GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》；脂肪含量測定參照GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測定》；灰分含量測定參照GB 5009.4—2010《食品中灰分的測定》。

1.3.3 鮑內(nèi)臟多肽分子質(zhì)量的測定

參照GB/T 22729—2008《海洋魚低聚肽粉》，色譜條件：本實驗使用的凝膠柱為TSKgel G2000SWXL（7.8 mm×300 mm）；流動相為乙腈-超純水-三氟乙酸（45∶55∶0.1，V/V），流速0.5 mL/min；檢測波長為220 nm；柱溫30 ℃。校正曲線所用的標(biāo)準(zhǔn)品：GSH（分子質(zhì)量307 Da）、GSSG（分子質(zhì)量613 Da）、生長抑制素（分子質(zhì)量1 636.7 Da）、抑肽酶（分子質(zhì)量6 512 Da）、細(xì)胞色素c（分子質(zhì)量12 384 Da）。

1.3.4 DPPH自由基清除率測定方法

稱取20 mg的DPPH用無水乙醇溶解定容于500 mL容量瓶中。實驗分為樣品組（2 mL DPPH溶液+2 mL樣品溶液）、對照組（2 mL乙醇+2 mL樣品溶液）和空白組（2 mL DPPH溶液+2 mL溶劑）。不同的樣品液充分混勻，靜置30 min后在517 nm波長處測定吸光度[13]。DPPH自由基清除率根據(jù)式（1）計算。

式中：A0、A1、A2分別為空白組、對照組、樣品組的吸光度。

1.3.5 ·OH清除率測定

根據(jù)Fenton反應(yīng)所產(chǎn)生的羥自由基（·OH）含量與H2O2濃度成正比，當(dāng)給予電子受體后，用Griess試劑顯色，形成紅色物質(zhì)，其呈色與·OH含量的多少成正比關(guān)系。嚴(yán)格按照試劑盒說明操作，VC及樣品不同濃度下的·OH清除率分別根據(jù)式（2）、（3）計算。

式中：Aj、Ai、Ab分別為樣品管、對照管、空白管在550 nm波長處的吸光度。

1.3.6 動物分組及給藥

1.3.6.1 體內(nèi)抗氧化活性實驗的動物分組及給藥

KM小鼠適應(yīng)環(huán)境后，隨機分為7 組，每組10 只。分別為空白對照組，模型對照組，陽性對照組，AVPP低、中、高劑量組，AVCE組?？瞻讓φ战M和模型對照組每天灌胃等體積的生理鹽水，以VC為陽性對照組。參考文獻[14]，劑量設(shè)為VC 10 mg/（kg·d），AVPP低、中、高劑量組分別為300、600、1 200 mg/（kg·d），AVCE組為600 mg/（kg·d）。連續(xù)灌胃30 d后，除空白對照組外，其他各組小鼠禁食16 h，然后一次性灌胃給予50%乙醇溶液12 mL/kg mb，6 h后取材[15]，測定小鼠肝組織中丙二醛含量、蛋白質(zhì)羰基含量、GSH含量以及SOD活力。

1.3.6.2 免疫調(diào)節(jié)活性實驗動物的分組及給藥

BALB/c小鼠適應(yīng)環(huán)境后，隨機分為6 組，每組16 只。分別為空白對照組（生理鹽水），陽性對照組（25 mg/（kg·d）鹽酸左旋咪唑），AVPP低、中、高劑量組（300、600、1 200 mg/kg·d），AVCE組（600 mg/（kg·d）），灌胃給藥。

1.3.7 抗氧化活性指標(biāo)測定

SOD活力、GSH、MDA及蛋白質(zhì)羰基含量均按照各試劑盒說明書方法進行測定。

1.3.8 免疫活性指標(biāo)測定

遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)、小鼠血清溶血素含量、小鼠碳廓清能力、吞噬指數(shù)的測定分別參照《增強免疫力功能評價方法》中足跖增厚法、血凝法、小鼠碳廓清實驗等方法進行測定[16]；免疫器官指數(shù)的測定：將小鼠處死，解剖后取出脾臟和胸腺，用濾紙吸干后，稱質(zhì)量。胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)分別按式（4）、（5）計算。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 17.0軟件對各組數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，Duncan法進行多重比較，結(jié)果用 ±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料和樣品的基本成分分析

表1 原料和AVPP的基本成分Table1 Proximate compositions of abalone viscera and AVPP

由表1可知，原料鮑內(nèi)臟粉及AVCE組成成分近似，均以蛋白質(zhì)為主，含量大于55%，其次為多糖，占比接近18%，原料中灰分含量較高，這主要是與其生存的海洋環(huán)境有關(guān)。與前兩者相比，AVPP的粗蛋白含量大幅增加，占比70.3%，而多糖含量顯著降低，僅有2.20%，這表明實驗采用的制備工藝是有效可行的，通過超濾可以將AVCE簡單地按分子質(zhì)量大小進行分離。

2.2 AVPP的分子質(zhì)量分布

圖1 AVPP的分子質(zhì)量分布Fig.1 Molecular mass distribution of AVPP

為了研究AVPP的分子質(zhì)量分布，本實驗選用了5 種標(biāo)準(zhǔn)品，分別為GSH、GSSG、生長抑制素、抑肽酶和細(xì)胞色素c。通過標(biāo)準(zhǔn)品過凝膠柱的色譜圖，測定酶解產(chǎn)物中AVPP樣品的分子質(zhì)量。標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的洗脫時間如圖1所示。其中細(xì)胞色素c洗脫時間為11.62 min，抑肽酶為13.56 min，生長抑制素為15.7 min，GSSG為18.38 min，GSH為19.58 min。相同條件下測定AVPP的分子質(zhì)量，其分子質(zhì)量的分布如圖1所示。AVPP的分子質(zhì)量主要分布在192～938 Da，這部分的峰面積占總面積的76.3%。

2.3 AVPP的體外抗氧化活性分析

2.3.1 AVPP對DPPH自由基的清除作用

圖2 VC（a）和AVPP（b）對DPPH自由基的清除作用Fig.2 DPPH radical scavenging activity of VC (a) and AVPP (b)

由圖2可知，VC具有很強的DPPH自由基清除活性，AVCE和AVPP的清除活性相對較弱。隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，兩者清除率也隨之增加，且AVCE的DPPH自由基清除率高于AVPP。當(dāng)質(zhì)量濃度為5 mg/mL時，AVCE的清除率達到最大值為40.5%，之后基本保持平衡；當(dāng)質(zhì)量濃度為10 mg/mL時，AVPP的DPPH自由基清除率達到最大值，為32.7%。說明AVPP和AVCE均具有一定的清除DPPH自由基的作用，且AVCE的清除能力較好。

2.3.2 AVPP對·OH的清除作用

圖3 VC（a）和AVPP（b）對·OH的清除作用Fig.3 Hydroxyl radical scavenging activity of VC (a) and AVPP (b)

由圖3可知，與VC相比，AVCE和AVPP清除·OH的能力相對較弱。隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，兩者清除·OH的能力也隨之升高。當(dāng)質(zhì)量濃度低于1 mg/mL時，AVCE清除·OH的能力大于AVPP，當(dāng)質(zhì)量濃度為2 mg/mL時，二者的清除效果相近；當(dāng)質(zhì)量濃度大于2 mg/mL時，AVPP清除·OH的能力大于AVCE。對二者的曲線做回歸方程并計算半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50），AVPP的IC50為2.1 mg/mL，AVCE為2.4 mg/mL。說明AVPP和AVCE均具有一定的清除·OH能力，且AVPP的清除作用優(yōu)于AVCE。

2.4 AVPP對小鼠體質(zhì)量的影響

表2 AVPP對小鼠體質(zhì)量的影響Table2 Effect of AVPP on body weights of mice

由表2可知，與空白對照組相比，各組小鼠灌胃前體質(zhì)量無明顯差異（P＞0.05），說明實驗具有統(tǒng)計學(xué)意義。連續(xù)灌胃30 d后，各組小鼠之間的體質(zhì)量均無明顯差異（P＞0.05），各組小鼠灌胃前后體質(zhì)量的增加量也無明顯差異（P＞0.05），由此說明，AVPP和AVCE均不會影響小鼠體質(zhì)量的正常增長，對小鼠沒有毒副作用。

2.5 AVPP的體內(nèi)抗氧化活性分析

表3 AVPP對小鼠體內(nèi)抗氧化指標(biāo)的影響Table3 Effect of AVPP on antioxidant indexes of mice

采用小鼠乙醇氧化損傷模型，考察AVPP的體內(nèi)抗氧化活性，小鼠肝組織中MDA、蛋白質(zhì)羰基、GSH含量和SOD活力分別反映脂質(zhì)氧化產(chǎn)物、蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物、抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶4 項指標(biāo)。由表3可知，與空白對照組相比，模型對照組小鼠肝臟內(nèi)SOD活力、GSH含量均極顯著降低（P＜0.01），MDA和蛋白質(zhì)羰基含量均高于空白對照組，且具有極顯著差異（P＜0.01），說明利用乙醇氧化損傷造模成功。

從抗氧化酶和抗氧化物質(zhì)兩項指標(biāo)看，AVCE和AVPP各劑量組SOD活力和GSH含量均極顯著高于模型對照組（P＜0.01），且隨著AVPP劑量的增大，均有不同幅度的增加，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。與模型對照組比較，AVCE組和AVPP中劑量組SOD活力分別提高了59.7%和33.2%，GSH含量分別提高了1.5 倍和1.3 倍，已接近或超過了陽性對照的水平。說明AVCE和AVPP都能有效增強受傷小鼠體內(nèi)SOD活力和GSH含量，減輕或避免超氧陰離子自由基的損傷，幫助氧化損傷機體內(nèi)的抗氧化酶和抗氧化物質(zhì)含量恢復(fù)正常水平，提高機體的抗氧化能力，且AVCE效果更好，這可能與AVCE中其他抗氧化物質(zhì)如多糖、不飽和脂肪酸及它們與AVPP的協(xié)同作用有關(guān)。從脂質(zhì)氧化產(chǎn)物和蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物兩項指標(biāo)看，AVCE和AVPP各劑量組MDA和蛋白質(zhì)羰基含量均明顯低于模型對照組，且AVPP各劑量組之間存在一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。AVCE組和AVPP中劑量組MDA含量比模型對照組分別降低了48.3%和43.9%，蛋白質(zhì)羰基含量則分別降低了31.6%和40.7%。AVPP高劑量組的兩項指標(biāo)已經(jīng)優(yōu)于陽性對照組。這表明AVCE和AVPP均能有效降低受損機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度和蛋白質(zhì)的氧化損傷程度，且AVPP表現(xiàn)出更好的活性。

2.6 AVPP的免疫調(diào)節(jié)活性分析

通過測定小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（足跖增厚）、血清溶血素水平（抗體水平）、碳廓清能力（吞噬指數(shù)）、免疫器官指數(shù)（脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)）等指標(biāo)，從細(xì)胞免疫、體液免疫、非特異性免疫及免疫器官4 個方面探究AVPP的免疫調(diào)節(jié)活性。遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)是由致敏性T細(xì)胞介導(dǎo)的一種細(xì)胞免疫反應(yīng)，測定各組小鼠的局部腫脹程度（足跖增厚）可以反映變態(tài)反應(yīng)的強度。通過用SRBC免疫動物后，使小鼠體內(nèi)B細(xì)胞增殖分化產(chǎn)生抗SRBC抗體（溶血素），利用其凝集SRBC的程度來檢測溶血素的水平[17]，以此來評價機體的體液免疫功能。碳廓清法常被用來檢測單核/巨噬細(xì)胞吞噬能力的高低[18]，通過給小鼠注射印度墨汁，測定吞噬指數(shù)來評價非特異性免疫功能。免疫器官指數(shù)是胸腺或脾臟的相對質(zhì)量，可反映機體免疫細(xì)胞的生長發(fā)育、增殖及功能狀態(tài)，對脾臟和胸腺指數(shù)的考察也是對機體免疫功能評價的一項重要指標(biāo)[19]。

表4 AVPP對小鼠免疫指標(biāo)的影響Table4 Effect of AVPP on immune indexes of mice

由表4數(shù)據(jù)可知，AVPP各劑量組和AVCE的各項免疫活性指標(biāo)均比空白對照組有不同程度的提高，并且要高于陽性對照組的相應(yīng)指標(biāo)。其中，足跖增厚、抗體水平、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)4 個指標(biāo)，AVCE和AVPP各劑量組均極顯著地高于空白對照組（P＜0.01），與空白對照組相比，AVPP中劑量組和AVCE組小鼠足跖增厚分別提高了77.1%和75.4%，抗體水平分別提高了28.0%和48.3%，脾臟指數(shù)分別提高24.9%和23.9%，胸腺指數(shù)分別提高了1.2 倍和0.9 倍。而對于吞噬指數(shù)這一指標(biāo)，AVPP中劑量組和空白對照組相近，AVCE組比空白對照組提高了7%，只有AVPP高劑量組極顯著高于空白對照組（P＜0.01）。比較AVPP不同劑量組的各項指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，除了兩個免疫器官指數(shù)外，其余3 個指標(biāo)均呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。表4數(shù)據(jù)反映，AVPP和AVCE均能從細(xì)胞免疫、體液免疫、非特異性免疫和免疫器官4 個方面增強小鼠的免疫活性，且效果優(yōu)于陽性對照。

3 討 論

自由基是機體內(nèi)代謝氧化還原網(wǎng)絡(luò)中的重要一環(huán)，在免疫細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中起介導(dǎo)、調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，也是抵御外來致病因素的有利武器[20]。免疫細(xì)胞在應(yīng)答免疫反應(yīng)時，可通過多種自由基機制表達其防御反應(yīng)，如通過還原型輔酶Ⅰ氧化酶系統(tǒng)誘導(dǎo)的免疫細(xì)胞呼吸爆發(fā)所產(chǎn)生的活性氧及其所衍生自由基，能逸出細(xì)胞外，引起組織損傷，甚至導(dǎo)致疾病的發(fā)生[21]。生物體內(nèi)過量的自由基會攻擊機體的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類、DNA等，使其氧化損傷，從而加快機體氧化衰老進程，引發(fā)各類疾病[22]。海洋生物活性物質(zhì)如多酚類、多糖類、多肽類等具有很好的抗氧化功能，通過清除體內(nèi)自由基和抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，保護生物大分子免受氧化損傷，與人工合成的抗氧化劑相比具有種類多、來源廣、安全性高、抗氧化效果顯著等優(yōu)點。本研究考察了AVPP的抗氧化及免疫調(diào)節(jié)活性，試圖為研究機體免疫與清除自由基抗氧化作用之間的相關(guān)性及海洋生物活性肽的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

采用堿性蛋白酶酶解，結(jié)合超濾方法，制備了AVPP樣品，未經(jīng)超濾處理的AVCE蛋白含量56.0%，多糖含量17.70%，經(jīng)過超濾處理的AVPP樣品蛋白含量大幅增加到70.3%，而多糖含量則降低到2.2%。但無論原料還是AVCE或AVPP樣品，灰分含量都較高，均大于10%；因此，采用何種方法有效脫鹽去除灰分成為后續(xù)關(guān)系到AVPP開發(fā)應(yīng)用亟待解決的問題。

肽的分子質(zhì)量大小與其活性有很大的影響，林燕等[23]利用不同孔徑大小的超濾膜，制備了分子質(zhì)量小于3 kDa、3～10 kDa及大于10 kDa的多肽組分，發(fā)現(xiàn)不管還原能力還是體外清除自由基能力，分子質(zhì)量小于3 kDa組分都顯著高于其他組分。Tang Xueyan等[24]在玉米醇溶蛋白水解物抗氧化活性研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過超濾分級后的小分子在清除DPPH自由基和超氧陰離子活性方面顯著高于其他組分。目前，一般認(rèn)為具有較高抗氧化活性的肽段分子質(zhì)量較小，這可能是因為小分子肽空間位阻小，更易與自由基接觸。本實驗制備的AVPP經(jīng)HPLC檢測，分子質(zhì)量主要分布在192～938 Da，占總產(chǎn)物的76.3%。

有研究表明，多肽的抗氧化機理可能有猝滅單線態(tài)氧、自由基清除和金屬離子螯合作用3 種[25]，因此本研究首先考察了AVPP的體外自由基清除能力，結(jié)果表明，AVCE對DPPH自由基的清除效果要優(yōu)于AVPP，最大清除率分別為40.5%和32.7%，而對羥自由基的清除效果AVPP要優(yōu)于AVCE，兩者的IC50分別為2.1 mg/mL和2.4 mg/mL。隨AVPP劑量的增加，對兩種自由基清除能力也隨之增加，但兩者對自由基的清除效果都要遠(yuǎn)低于VC，說明制備的AVPP具有一定的體外自由基清除能力。這與Zhou Dayong等[26]得到的鮑內(nèi)臟酶解產(chǎn)物的體外抗氧化活性結(jié)果相符；另外，趙莎莎等[27]從青蛤中、曹榮等[28]從刺參腸和性腺得到的多肽以及其他多篇文獻都證實了海洋生物來源的多肽具有一定的體外抗氧化活性。

為考察AVPP的體內(nèi)抗氧化活性，根據(jù)保健食品抗氧化功能評價方法，選取SOD、MDA、GSH和蛋白質(zhì)羰基4 項評定指標(biāo)。其中，SOD是體內(nèi)重要的抗氧化酶，GSH是生物體內(nèi)重要的還原劑，MDA是脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物，蛋白質(zhì)羰基作為蛋白質(zhì)氧化的產(chǎn)物，是機體內(nèi)蛋白質(zhì)遭到自由基攻擊的重要標(biāo)志[29]。本研究結(jié)果顯示，AVPP能極顯著增強受傷小鼠體內(nèi)SOD活力和GSH含量，AVPP中劑量組SOD活力和GSH含量分別提高了33.2%和1.3 倍，而脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA和蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物蛋白質(zhì)羰基含量均明顯低于模型對照組，中劑量組MDA和蛋白質(zhì)羰基含量分別降低43.9%和40.7%，各項指標(biāo)均已接近或超過了陽性對照的水平，且呈現(xiàn)一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。根據(jù)保健食品抗氧化功能評價方法結(jié)果判定，動物實驗中脂質(zhì)氧化產(chǎn)物、蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物、抗氧化酶、抗氧化物質(zhì)4 項指標(biāo)中3 項陽性，可判定該受試樣品具有抗氧化功能，本研究中4 項指標(biāo)均為陽性，因此可判定AVPP具有抗氧化活性，且AVCE與AVPP抗氧化效果進行綜合比較，無顯著性差異。許多其他海洋生物來源的活性肽同樣表現(xiàn)出較好的抗氧化活性，Mendis等[30]從一種烏賊體內(nèi)提取得到一種活性肽具有很好的脂質(zhì)過氧化抑制效果，其活性高于VE，與二丁基羥基甲苯相當(dāng)；林琳等[31]研究發(fā)現(xiàn)，秘魯魷魚皮膠原蛋白肽可以提高小鼠體內(nèi)SOD和GSH-Px的活力，降低MDA含量；王天明等[32]從海地瓜中分離得到3 種多肽，能夠明顯增強細(xì)胞抗H2O2氧化損傷能力，其中分子質(zhì)量小于3 kDa的多肽抗氧化活性最高。

海洋生物來源的免疫活性肽因具有較高的生物活性、較弱的免疫原性、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，而被人們廣泛關(guān)注。Wang Yukai等[33]把酶解產(chǎn)生的含有寡肽的牡蠣水解液用于S180荷瘤小鼠后，小鼠胸腺和脾臟指數(shù)，自然殺傷細(xì)胞的活性、脾臟淋巴細(xì)胞的增殖及巨噬細(xì)胞的吞噬作用都有顯著增加；杜正彩等[34]研究表明，文蛤多肽對地塞米松造成的免疫抑制小鼠具有免疫調(diào)節(jié)恢復(fù)作用。本研究考察了AVPP的免疫活性，結(jié)果表明，除了反應(yīng)非特異性免疫功能的吞噬指數(shù)外，其余指標(biāo)均極顯著高于空白對照組（P＜0.01），與空白對照組相比，AVPP中劑量組小鼠足跖增厚提高77.1%，抗體水平提高28.0%，脾臟指數(shù)提高24.9%，胸腺指數(shù)提高1.2 倍。并且除了免疫器官指數(shù)外，其余3 個指標(biāo)均呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。這表明，AVPP可以從細(xì)胞免疫、體液免疫、非特異性免疫和免疫器官4 個方面增強小鼠免疫功能，且效果優(yōu)于陽性對照。

本研究通過生物酶解和超濾技術(shù)聯(lián)合制備AVPP，并通過動物實驗證實了其抗氧化活性和免疫促進活性。但對于超濾處理中被截留的大分子部分尚未進行分析研究，結(jié)合文獻報道及實際測定的組成成分，可以推測，被截留的部分中應(yīng)以多糖成分為主，而海洋生物來源的多糖同樣具有多種生物活性，是具有很大開發(fā)潛力的功能因子；因此，后續(xù)應(yīng)進一步完善制備工藝，對超濾截留的大分子部分的組成及活性進行研究。最終的研究成果一方面可以為工業(yè)化開發(fā)鮑內(nèi)臟系列功能食品提供數(shù)據(jù)支持；另一方面，鮑內(nèi)臟的有效利用可以極大地減少優(yōu)質(zhì)海洋生物資源的浪費和環(huán)境污染，對提高鮑產(chǎn)品附加值、完善加工產(chǎn)業(yè)鏈將起到積極的推動作用。

[1] 葉燕軍, 陳俊, 翁武銀. 超濾膜分離鮑魚內(nèi)臟酶解物及其體外抗氧化活性的研究[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2015, 31(5): 130-136; 284.DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2015.5.021.

[2] 吳歡歡, 黃倩雯, 熊夏玲, 等. 鮑魚養(yǎng)殖技術(shù)[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2014(17): 298. DOI:10.3969/j.issn.1007-5739.2014.17.177.

[3] 薛長湖, 林洪, 曾名勇, 等. 我國水產(chǎn)品加工的現(xiàn)狀和未來[J]. 科學(xué)養(yǎng)魚, 2002(2): 6-7.

[4] 林國榮, 吳明霞, 張澤生, 等. 南日鮑營養(yǎng)成分分析及評價[J].營養(yǎng)學(xué)報, 2015, 37(1): 99-101. DOI:10.13325/j.cnki.acta.nutr.sin.2015.01.034.

[5] ZHU B W, LI D M, ZHOU D Y, et al. Structural analysis and CCK-releasing activity of a sulphated polysaccharide from abalone (Haliotis discus Hannai Ino) viscera[J]. Food Chemistry, 2011, 125(4): 1273-1278. DOI:10.1016/j.foodchem.2010.10.065.

[6] 劉艷青, 李兆杰, 李國云, 等. 雌、雄皺紋盤鮑內(nèi)臟脂肪酸及磷脂組成的比較分析[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(10): 184-186. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201310040.

[7] 鄭惠娜, 章超樺, 曹文紅. 海洋蛋白酶解制備生物活性肽的研究進展[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2008, 27(7): 370-373. DOI:10.3969/j.issn.1003-1111.2008.07.013.

[8] KLEEKAYAI T, HARNEDY P A, O’KEEFFE M B, et al. Extraction of antioxidant and ACE inhibitory peptides from Thai traditional fermented shrimp pastes[J]. Food Chemistry, 2015, 176: 441-447.DOI:10.1016/j.foodchem.2014.12.026.

[9] NGUYEN V T, QIAN Z J, RYU B M, et al. Matrix metalloproteinases(MMPs) inhibitory effects of an octameric oligopeptide isolated from abalone Haliotis discus hannai[J]. Food Chemistry, 2013, 141(1): 503-509. DOI:10.1016/j.foodchem.2013.03.038.

[10] LIU Z Y, ZENG M Y, DONG S Y, et al. Effect of an antifungal peptide from oyster enzymatic hydrolysates for control of gray mold (Botrytis cinerea) on harvested strawberries[J]. Postharvest Biology and Technology, 2007, 46(1): 95-98. DOI:10.1016/j.postharvbio.2007.03.013.

[11] ZHU C F, PENG H B, LIU G Q, et al. Beneficial effects of oligopeptides from marine salmon skin in a rat model of type 2 diabetes[J]. Nutrition, 2010, 26(10): 1014-1020. DOI:10.1016/j.nut.2010.01.011.

[12] JIN Y, ZHANG L N, ZHANG M, et al. Antitumor activities of hetyeropolysaccharides of Porta rows mycelia from different strains and culture media[J]. Carbohydrate Research, 2003, 338(14): 1517-1521. DOI:10.1016/S0008-6215(03)00198-8.

[13] 劉帥濤, 陶慧林, 李錦艷, 等. 4 種黃酮小分子對DPPH自由基的清除作用及構(gòu)效關(guān)系研究[J]. 分析測試學(xué)報, 2012, 31(1): 71-75.DOI:10.3969/j.issn.1004-4957.2012.01.013.

[14] 盧曉燕. PEF結(jié)合酶法提取鮑魚臟器粗多糖及其抑菌、免疫活性研究[D]. 福州: 福建農(nóng)林大學(xué), 2012: 41.

[15] 張揚, 孫和平, 劉卓, 等. 紫蘇油在乙醇誘導(dǎo)氧化損傷模型小鼠體內(nèi)的抗氧化作用[J]. 食品科學(xué), 2015, 36(23): 279-282. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201523051.

[16] 國家食品藥品監(jiān)督管理局保健食品化妝品監(jiān)管司. 增強免疫力功能評價方法(征求意見稿)及修訂說明[EB/OL]. (2012-11-02) [2017-03-20]. http://www.docin.com/p-554888103.html.

[17] 李曉梅, 鞠玉琳. 中藥“FH”對小鼠血清溶血素和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響[J]. 延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報, 2005, 27(3): 197-200. DOI:10.3969/j.issn.1004-7999.2005.03.009.

[18] 張珣, 王靜鳳, 李冰, 等. 阿膠對小鼠免疫功能的影響[J]. 食品工業(yè)科技,2011, 32(11): 400-402; 433. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2011.11.024.

[19] SUSZKO A, SZCZYPKA M, LIS M, et al. Inf l uence of polysaccharide fraction C isolated from Caltha palustris L. on T and B lymphocyte subsets in mice[J]. Central-European Journal of Immunology, 2012,37(3): 193-199. DOI:10.5114/ceji.2012.30792.

[20] 方允中, 鄭榮梁. 自由基生物學(xué)的理論與應(yīng)用[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2002: 122-161.

[21] UTHAISANGSOOK S, DAY N K, BAHNA S L, et al. Innate immunity and its role against infections[J]. Annals of Allergy,Asthma & Immunology, 2002, 88(3): 253-265. DOI:10.1016/S1081-1206(10)62005-4.

[22] HARMAN D. Aging: a theory based on free radical and radiation chemistry[J]. Journal of Gerontology, 1956, 11(3): 298-300.DOI:10.1093/geronj/11.3.298.

[23] 林燕, 陳計巒, 胡小松, 等. 酶解核桃蛋白制備抗氧化肽的研究[J].食品工業(yè)科技, 2011, 32(4): 204-207; 212. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2011.04.052.

[24] TANG Xueyan, HE Zhiyong, DAI Yanfeng, et al. Peptide fractionation and free radical scavenging activity of zein hydrolysate[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58(1): 587-593. DOI:10.1021/jf9028656.

[25] 王瑞雪, 孫洋, 錢方, 等. 抗氧化肽及其研究進展[J]. 食品科技, 2011,36(5): 83-86. DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2011.05.039.

[26] ZHOU Dayong, ZHU Beiwei, QIAO Lu, et al. In vitro antioxidant activity of enzymatic hydrolysates prepared from abalone (Haliotis discus hannai Ino) viscera[J]. Food and Bioproducts Processing, 2012,90(2): 148-154. DOI:10.1016/j.fbp.2011.02.002.

[27] 趙莎莎, 潘欣, 趙玉勤, 等. 青蛤酶解多肽體外抗氧化活性的研究[J].浙江海洋學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版), 2015, 34(1): 45-49. DOI:10.3969/j.issn.1008-830X.2015.01.009.

[28] 曹榮, 李冬燕, 劉淇, 等. 刺參腸、性腺酶解多肽體外抗氧化作用研究[J]. 南方水產(chǎn)科學(xué), 2013, 9(6): 47-51. DOI:10.3969/j.issn.2095-0780.2013.06.008.

[29] ZHANG Yingcai, ZHANG Qi, LI Hua, et al. Prognostic factors for late mortality after liver transplantation for benign end-stage liver disease[J]. Chinese Medical Journal, 2011, 124(24): 4229-4235.DOI:10.3760/cma.j.issn.0366-6999.2011.24.020.

[30] MENDIS E, RAJAPAKSE N, BYUN H G, et al. Investigation of jumbo squid (Dosidicus gigas) skin gelatin peptides for their in vitro antioxidant effects[J]. Life Sciences, 2005, 77(17): 2166-2178.DOI:10.1016/j.lfs.2005.03.016.

[31] 林琳, 李八方. 魷魚皮膠原蛋白水解肽抗氧化活性研究[J]. 中國海洋藥物, 2006, 25(4): 48-51. DOI:10.3969/j.issn.1002-3461.2006.04.012.

[32] 王天明, 蘇意鋼, 馬永鈞, 等. 海地瓜多肽分離及抗氧化活性研究[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2014, 30(5): 75-81; 166. DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2014.05.022.

[33] WANG Yukai, HE Hailun, WANG Guofan, et al. Oyster (Crassostrea gigas) hydrolysates produced on a plant scale have antitumor activity and immunostimulating effects in BALB/c mice[J]. Marine Drugs,2010, 8(2): 255-268. DOI:10.3390/md8020255.

[34] 杜正彩, 侯小濤, 鄧家剛, 等. 文蛤粗多肽對免疫抑制小鼠TNF-α,IL-2及IFN-γ的影響[J]. 廣西中醫(yī)藥, 2014, 37(5): 71-74.