益氣健脾通便方對(duì)慢傳輸型便秘大鼠Cajal間質(zhì)細(xì)胞及一氧化氮、一氧化氮合酶的影響

王建民，王培森，唐 冉

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，安徽 合肥 230012)

慢傳輸型便秘(slow transit constipation，STC)是指因胃腸道功能改變，動(dòng)力減弱，傳導(dǎo)失常而導(dǎo)致的便秘[1]。流行病學(xué)研究顯示，STC是臨床常見的病癥,占便秘發(fā)病率的18%～42%,約占功能性便秘發(fā)病率的45.5%[2]。其發(fā)病機(jī)制與腸神經(jīng)遞質(zhì)、結(jié)腸肽類激素、Cajal間質(zhì)細(xì)胞(Cajal interstitial cells，ICC)等密切相關(guān)。ICC是廣泛存在于腸神經(jīng)系統(tǒng)與平滑肌之間的一類極其特殊的間質(zhì)細(xì)胞[3]，是胃腸道慢波的起搏細(xì)胞，對(duì)調(diào)控腸神經(jīng)信號(hào)傳遞到效應(yīng)器平滑肌細(xì)胞起著重要的作用[4]。一氧化氮(nitric oxide, NO)是腸神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)之一，能抑制胃腸道平滑肌的運(yùn)動(dòng)[5],一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)是NO合成過程中唯一的酶，而且NOS表達(dá)的增多，也可以持續(xù)性地抑制胃腸道的運(yùn)動(dòng)。本研究通過益氣健脾通便方干預(yù)STC大鼠模型，進(jìn)一步探討其對(duì)ICC及NO、NOS的影響及其調(diào)控腸道運(yùn)動(dòng)的作用機(jī)制，為益氣健脾通便方治療STC提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性8周齡Wistar大鼠60只，體質(zhì)量(200±20)g，由安徽省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK2012(皖)-0020，將其隨機(jī)分成正常組，模型組，益氣健脾通便方低、中、高劑量組，莫沙必利組，每組10只。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 藥物與試劑 益氣健脾通便方(白術(shù)20 g，黃芪、當(dāng)歸、炒枳實(shí)、黨參各15 g，陳皮、杏仁各10 g，炙甘草6 g)：由安徽省中醫(yī)院中藥房提供，由制劑室代煎成水煎劑，含生藥1.2 g/mL；枸櫞酸莫沙必利片(批號(hào) H19990317)：魯南貝特制藥有限公司；復(fù)方地芬諾酯(批號(hào) H41023578)：中孚藥業(yè)有限公司；活性炭：杭州鑫膜實(shí)業(yè)有限公司；大鼠NO、NOS試劑盒：上海雙贏生物試劑有限公司；無水乙醇、二甲苯：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；檸檬酸(pH 6.0)抗原修復(fù)液、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)、胎牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)：合肥知恩生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器 DHP-360A型電熱恒溫培養(yǎng)箱：山東省菏澤市俊騰電子儀器有限公司；JA-21002型電子精密天平：上海雙旭電子有限公司；脫水機(jī)(JJ-12J)、包埋機(jī)(JB-P5)：武漢俊杰電子有限公司；病理切片機(jī)(RM2016)：上海徠卡儀器有限公司；脫色搖床(TSY-B)、渦旋混合器(MX-F)：Servicebio；顯微鏡(XSP-C204)：CIC。

2 方法

2.1 模型復(fù)制方法 參照文獻(xiàn)[6]方法，應(yīng)用復(fù)方地芬諾酯混懸液灌胃復(fù)制STC大鼠模型,模型組大鼠每日給予復(fù)方地芬諾酯混懸液(8 mg/kg)灌胃1次,連續(xù)14 d。正常組大鼠以等容量生理鹽水灌胃。當(dāng)大鼠出現(xiàn)糞便量少且干時(shí)，則STC大鼠模型復(fù)制成功，停止復(fù)方地芬諾酯灌胃。

2.2 給藥方法 模型復(fù)制成功后第2天開始，按大鼠用藥劑量相當(dāng)于60 kg成人臨床用量的6倍，計(jì)算大鼠的給藥劑量。益氣健脾通便方低、中、高劑量組大鼠每日分別給予益氣健脾通便方6、12、18 g/kg灌胃；莫沙比利組大鼠給予0.15 mg/mL莫沙比利[1.5 mg/(kg·d)]灌胃；正常組和模型組大鼠分別以等容量生理鹽水灌胃。各組均連續(xù)灌胃4周。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 大鼠一般情況 觀察各組大鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)狀況、毛發(fā)光澤度、大便性狀等。

2.3.2 大鼠糞便粒數(shù)及含水率檢測(cè) 模型復(fù)制前1周，模型復(fù)制第2周及治療第1、2、3、4周，每日收集各組大鼠糞便，每晚同一時(shí)間段(18:00-20:00)記錄糞便顆粒數(shù)，并測(cè)定糞便含水率。使用電子精密天平稱量大鼠濕糞質(zhì)量，記為濕質(zhì)量，將各組大鼠糞便放入80 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中4 h后再稱質(zhì)量，記為干質(zhì)量。糞便含水率為糞便濕質(zhì)量與糞便干質(zhì)量的差值占糞便濕質(zhì)量的百分比[7]。

2.3.3 大鼠腸道傳輸功能檢測(cè) 末次灌胃結(jié)束后，大鼠禁食不禁水24 h，用活性炭混懸液按4 mL/kg灌胃30 min后，將大鼠以頸椎脫臼法處死，隨后剖腹，摘出從幽門下端至直腸末端的腸道，測(cè)量摘出腸道的長度及活性炭混懸液在腸道內(nèi)的推進(jìn)長度，并計(jì)算推進(jìn)長度占摘出腸道長度的百分比[8]。

2.3.4 大鼠NO、NOS含量的檢測(cè) 末次灌胃結(jié)束后，每組大鼠禁食不禁水24 h后，按150 mg/kg劑量給予5%水合氯醛腹腔注射麻醉，從腹腔下靜脈抽取5 mL血液，4 ℃靜置2 h以上，3 000 r/min離心10 min，吸取上清液，放至EP管中，封口，置-80 ℃冰箱中保存。按照比色法檢測(cè)血漿NO、NOS含量。

2.3.5 大鼠結(jié)腸組織ICC檢測(cè) 將大鼠麻醉后，取結(jié)腸組織，用生理鹽水沖洗后置于10%中性甲醛溶液中，常規(guī)脫水，石蠟包埋，制成4 μm連續(xù)切片，石蠟切片脫蠟至水；將切片置于盛滿檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液(pH 6.0)的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)，冷卻后用PBS(pH 7.4)洗滌3次；采用3%雙氧水溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS洗滌3次；在免疫組織化學(xué)圈內(nèi)滴加3% BSA均勻覆蓋組織，血清封閉；滴加一抗，4 ℃孵育過夜；PBS洗滌3次，在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的二抗(HRP標(biāo)記)覆蓋組織，室溫孵育50 min；PBS洗滌3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，脫水封片；顯微鏡下檢測(cè)，采用圖像采集系統(tǒng)ImagePro-Plus 6.0進(jìn)行分析，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(10×20倍)。以陽性細(xì)胞面積反映ICC表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 大鼠糞便形態(tài) 正常組大鼠精神活潑，運(yùn)動(dòng)靈活，毛發(fā)光亮，進(jìn)食、飲水正常，糞便顆粒大小、濕度正常；STC模型大鼠精神萎靡，皮毛無光澤，活動(dòng)遲鈍，糞便顆粒小而干，進(jìn)食量減少，無脫肛。結(jié)果提示STC大鼠模型復(fù)制成功。

3.2 益氣健脾通便方對(duì)STC大鼠糞便粒數(shù)和含水率的影響 含有一個(gè)重復(fù)測(cè)量變量的兩因素方差分析結(jié)果表明，時(shí)間因素和處理因素對(duì)大鼠糞便粒數(shù)和含水率的主效應(yīng)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩者的交互作用也均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在模型復(fù)制前1周，各組大鼠每日糞便粒數(shù)和含水率的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；模型復(fù)制第2周，模型組、莫沙必利組及益氣健脾通便方低、中、高劑量組大鼠每日平均糞便粒數(shù)和含水率均明顯降低，與正常組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療第1、2、3、4周，除正常組和模型組外，各治療組大鼠每日平均糞便粒數(shù)和含水率均較模型復(fù)制前1周有所上升，其中益氣健脾通便方中、高劑量組療效最為顯著。見表1、表2。

3.3 益氣健脾通便方對(duì)STC大鼠腸道推進(jìn)率的影響 與正常組比較，模型組大鼠腸道推進(jìn)率明顯下降(P<0.05)；與模型組比較，莫沙必利組與益氣健脾通便方低、中、高劑量組大鼠腸道推進(jìn)率均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；益氣健脾通便方中、高劑量組較莫沙必利組大鼠腸道推進(jìn)率有一定程度升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

3.4 益氣健脾通便方對(duì)STC大鼠NO、NOS表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組大鼠NO、NOS水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，莫沙必利組與益氣健脾通便方低、中、高劑量組大鼠NO、NOS水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；益氣健脾通便方高劑量組較莫沙必利組大鼠NO、NOS水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

3.5 益氣健脾通便方對(duì)STC大鼠結(jié)腸組織ICC的影響 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，ICC呈現(xiàn)棕黃色或者棕褐色，多位于環(huán)形肌與縱行肌之間，一般以面積代表ICC細(xì)胞大小。見圖1。與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織ICC面積明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，莫沙必利組，益氣健脾通便方低、中、高劑量組大鼠結(jié)腸組織ICC面積顯著升高(P<0.05)；與莫沙必利組比較，益氣健脾通便方高劑量組大鼠結(jié)腸組織ICC面積升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表1 6組大鼠糞便粒數(shù)比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與莫沙必利組比較，△P<0.05；與中藥低劑量組比較，◇P<0.05；與模型復(fù)制前1周比較，aP<0.05；與治療第1周比較，bP<0.05；中藥指益氣健脾通便方

表2 6組大鼠糞便含水率比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與莫沙必利組比較，△P<0.05；與中藥低劑量組比較，◇P<0.05；與模型復(fù)制前1周比較，aP<0.05；與治療第1周比較，bP<0.05；中藥指益氣健脾通便方

表3 6組大鼠腸道推進(jìn)率比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

表4 6組大鼠血漿NO、NOS水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與莫沙必利組比較，△P<0.05

4 討論

STC為臨床上常見的一種功能性腸道疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不能完全明確，且病情頑固，治療困難。西醫(yī)在治療上多采用促動(dòng)力藥及瀉藥，但長期服用此類藥物多會(huì)產(chǎn)生依賴性，且對(duì)腸神經(jīng)系統(tǒng)、胃腸激素等造成嚴(yán)重?fù)p害。

注：A.正常組；B.模型組；C.莫沙必利組；D.益氣健脾通便方低劑量組；E.益氣健脾通便方中劑量組；F.益氣健脾通便方高劑量組

圖1 6組大鼠結(jié)腸組織ICC表達(dá)水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

STC屬中醫(yī)學(xué)“便秘”范疇。古代文獻(xiàn)中對(duì)便秘早有諸多記載，如《蘭室秘藏·大便結(jié)燥門》謂：“若饑飽失節(jié)，勞役太甚，損傷胃氣，及食辛熱厚味之物，而助火邪，伏于血中，耗散真陰，津液虧少，故大便燥結(jié)?！敝嗅t(yī)學(xué)認(rèn)為便秘的病因是多種因素共同構(gòu)成的，外有寒熱之邪，內(nèi)有飲食情志失調(diào)，或久病體虛，氣血陰陽虧損等。其基本病機(jī)責(zé)之為臟腑功能失調(diào)，大腸傳導(dǎo)失司。

筆者經(jīng)過幾十年潛心研究，在便秘的診斷治療過程中，全面觀察患者的臨床表現(xiàn)、舌象、脈象，形成了一套以中醫(yī)理論為依據(jù)，強(qiáng)調(diào)辨證論治的診治體系，注重發(fā)揮中醫(yī)診療特色和優(yōu)勢(shì)。便秘的病位在大腸，與肺脾肝腎等臟腑功能失調(diào)密切相關(guān)，臨床上以脾氣虛導(dǎo)致的便秘最為常見，脾氣虛衰，推動(dòng)無力，腸道傳導(dǎo)失司，糟粕停聚而發(fā)為本病。對(duì)于脾氣虛型便秘，當(dāng)用益氣健脾、潤腸通便法，擬益氣健脾通便方。方中重用白術(shù)為君，意在健脾益氣；黨參健脾益肺，黃芪益中升清，共為臣藥，助君藥行健脾之效；木香行氣導(dǎo)滯，枳實(shí)消積化滯，杏仁降氣潤腸，助胃腸氣降，同時(shí)佐以當(dāng)歸、肉蓯蓉溫陽補(bǔ)血、潤腸通便，陳皮理氣健脾，共為佐藥；炙甘草益氣調(diào)和。諸藥同用，共奏健脾益氣、潤腸通便之功。本方以補(bǔ)為主，以通為輔，方中大量運(yùn)用益氣、健脾之藥，如白術(shù)、黃芪，使氣旺則大腸推動(dòng)有力，所謂“寓通于補(bǔ)之中”。中醫(yī)理論認(rèn)為“肺與大腸相表里”，本方運(yùn)用黨參補(bǔ)益肺氣，木香、枳實(shí)、杏仁降肺通腑，肺氣通調(diào)水道，布達(dá)津液于大腸，水足舟行，使大腸傳導(dǎo)功能正常發(fā)揮，所謂“從肺治腸”。本方具有寓通于補(bǔ)、肺腸同治的配伍特點(diǎn)。

STC的發(fā)病機(jī)制可能與結(jié)腸壁內(nèi)腸神經(jīng)遞質(zhì)的異常表達(dá)相關(guān)。NO作為腸神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)之一，對(duì)胃腸道的動(dòng)力調(diào)控具有極其重要的作用[9]。NOS是NO合成過程中唯一的酶，NOS通過催化L-精氨酸生成NO，其活性變化直接影響NO的生成量及其在血液中濃度，而且隨著NOS水平的升高，胃腸道的運(yùn)動(dòng)也將受到持續(xù)性抑制[10]。NOS分布廣泛，在胃腸壁全層均有分布，尤以平滑肌最多，NO可通過提高胃腸平滑肌內(nèi)環(huán)磷酸鳥苷的濃度而導(dǎo)致平滑肌松馳，引起胃腸運(yùn)動(dòng)減弱[5]。ICC多位于環(huán)形肌與縱行肌之間，可產(chǎn)生電信號(hào)，通過縫隙鏈接傳遞給平滑肌細(xì)胞，引起肌層的節(jié)律性收縮，從而激發(fā)胃腸道的運(yùn)動(dòng)。ICC對(duì)于一些腸神經(jīng)遞質(zhì)具有表達(dá)性，能合成、放大NO[11]。

本課題通過“復(fù)方地芬諾酯灌胃法”復(fù)制STC大鼠動(dòng)物模型，觀察大鼠的糞便粒數(shù)、糞便含水率、腸道推進(jìn)率、NO、NOS含量及結(jié)腸組織ICC表達(dá)量。研究結(jié)果表明，益氣健脾通便方能夠提高STC大鼠糞便粒數(shù)、糞便含水率及腸道推進(jìn)率，同時(shí)升高ICC表達(dá)量及降低NO、NOS的水平，從而改善便秘癥狀。益氣健脾通便方改善STC的作用機(jī)制可能與ICC表達(dá)量升高及腸神經(jīng)遞質(zhì)NO、NOS受到抑制有關(guān)。

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