傳統(tǒng)熱炸法對梅花鹿鹿茸不同部位細胞因子含量的影響

鄧紅梅，丁倩男，王春梅，賡迪，戴俊東，董玲

（北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100102）

鹿茸為鹿科動物梅花鹿（Cervus nippon Temminck）或馬鹿（CervuselaphusLinnaeus）的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，是我國傳統(tǒng)名貴中藥材，在我國東北、西北和內(nèi)蒙及西南山區(qū)均有分布，其中，吉林省產(chǎn)的梅花鹿鹿茸質(zhì)量最佳[1]。鹿茸是唯一能夠完全再生的哺乳動物器官，每年周期性地脫落，完全再生。鹿茸的生長速度在哺乳動物中是不可思議的，生長速度可達1cm/d～2cm/d[2]。鹿茸的藥理學(xué)功能也非常明確，《本草綱目》中記載：“鹿茸生精補髓、養(yǎng)血益陽、強筋健骨、益氣強志”?，F(xiàn)代科學(xué)研究證明，鹿茸具有促進機體生長發(fā)育、調(diào)節(jié)新陳代謝的功能[3]。近年來，國內(nèi)、外學(xué)者相繼在鹿茸中發(fā)現(xiàn)各種細胞生長因子，如胰島素樣生長因子（Insulin-1ikegrowthfactor，IGF）、表皮生長因子（Epidermal growth factor，EGF）、神經(jīng)生長因子（Nervegrowthfactor，NGF）等[4]。鹿茸的快速生長與鹿茸中生長因子的調(diào)節(jié)密切相關(guān)[5]，鹿茸的藥理功能也與鹿茸中所含的生長因子密不可分。因此，鹿茸中生長因子的含量變化與鹿茸的品質(zhì)是呈正相關(guān)的。

新鮮鹿茸中含有70%左右的水分，沒有及時干透或再受潮的鹿茸會在自身酶或外界腐敗菌的作用下變質(zhì)，降低或失去藥用價值。鹿茸需經(jīng)過炮制和干燥后進行保存、運輸和應(yīng)用。大部分市場銷售的鹿茸是采用傳統(tǒng)的沸水煮炸和風(fēng)干相結(jié)合的加工方法[6]，這種方法對鹿茸中的生長因子含量產(chǎn)生什么樣的影響呢？本研究對炮制前、后鹿茸細胞因子含量進行了測定，為鹿茸的加工工藝改進提供參考。

從組織學(xué)上看，鹿茸從頂端到基部是增生區(qū)、成熟區(qū)和肥大區(qū)（互有重疊，無法完全分開）、鈣化區(qū)。相對應(yīng)鹿茸飲片分4個等級，即一等：臘片；二等：粉片；三等：血片：四等：骨片。傳統(tǒng)認為，一等質(zhì)量最佳，依次遞減[7，8]?，F(xiàn)代實驗也證明，不同部位鹿茸的藥理活性差異很大，梢部最好，基部最差，與傳統(tǒng)認識相一致[9]。本研究比較了炮制前、后鹿茸上部（增生區(qū)）、中部（成熟區(qū)和肥大區(qū)）、下部（鈣化區(qū)）的生長因子含量變化，為鹿茸的質(zhì)量控制和評價提供依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 藥物與試劑

鮮梅花鹿茸二桿茸（偉博海泰生物技術(shù)有限公司，并由北京中醫(yī)藥大學(xué)戴俊東教授鑒定）；考馬斯亮藍G-250、牛血清白蛋白（BSA）（北京拜爾迪公司）；檢測生長因子EGF、NGF和IGF-1的ELISA試劑盒（Bluegene公司）；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

HH-S6B數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市正基儀器有限公司）；UV-2000紫外分光光度計（尤尼柯上海儀器有限公司）；ULT1386-3-V30超低溫冰箱（日本三洋電器公司）；SpectraMax190酶標儀（美國MD分子儀器公司）；Biofugestratos高速冷凍臺式離心機（Thermo公司）；FD-1A-50冷凍干燥機（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）；JMS-80B膠體磨（廊坊恒諾機械有限公司）；LambdaPlus單通道移液器（Corning上海管理有限公司）；BSA124S電子天平（Sartorius工業(yè)稱重設(shè)備北京有限公司）；Milli-Q Plus超純水制備系統(tǒng)（Millipore實驗室設(shè)備上海有限公司）。

2 實驗方法

2.1 鹿茸的分段

用酒精燈對新鮮二杠鹿茸火燎去毛，將去毛后鮮鹿茸切成上、中、下3部分，分別對應(yīng)未骨化、部分骨化和完全骨化部位。每部分均再縱向切成2份，1份作為鮮品，1份用保鮮膜裹住斷面，用于傳統(tǒng)炮制。

2.2 鹿茸的傳統(tǒng)炮制

按照文獻[10]所描述的方法進行，將鮮鹿茸反復(fù)放入沸水中以排盡血水，烘干水分至酥脆。

2.3 鹿茸可溶性蛋白樣品的制備

將鮮鹿茸和熱炸過的鹿茸切成薄片，液氮低溫條件下粉碎成末，按照固、液質(zhì)量比1∶2加入超純水，充分混懸，利用膠體磨對混懸液勻漿5min，4℃12000r/min離心15min，取上清，分裝于-80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 鹿茸可溶性蛋白質(zhì)濃度的測定

采用Bradford方法[11]對鹿茸水提上清液進行蛋白質(zhì)濃度測定。

2.5 生長因子含量的測定

采用酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）方法對各生長因子的含量進行測定，參考文獻[12]，按照試劑盒說明進行。

2.6 數(shù)據(jù)分析

Excel軟件對實驗數(shù)據(jù)進行整理，結(jié)果以x±s表示，利用SAS軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用t檢驗組間比較，P＜0.05有顯著性差異，P＜0.01有極顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 炮制前、后鹿茸不同部位可溶性蛋白含量

鹿茸中可溶性蛋白的含量從上部到下部依次降低，鮮品上部可溶性蛋白含量是下部的1.45倍。經(jīng)炮制處理后，鹿茸中可溶性蛋白的溶出量明顯減少，結(jié)果見表1。

表1 炮制前、后鹿茸不同部位可溶性蛋白含量Table 1 The content of the soluble proteins in the velvet antler before and after processing.

3.2 炮制前、后鹿茸不同部位EGF含量

鮮鹿茸的上部和中部能檢測到EGF含量，上部是中部的2.6倍；在鮮鹿茸下部未檢測到EGF。與鮮鹿茸相比，炮制后鹿茸中可溶性EGF含量明顯降低，只有上部能檢測到較低的含量；中、下部含量太低，未檢測到。見表2。

表2 炮制前、后鹿茸不同部位EGF含量Table 2 The content of the EGF in the velvet antler before and after processing.

3.3 炮制前、后鹿茸不同部位IGF-1含量

不同部位鮮鹿茸中均檢測到IGF-1，上部含量是中部的2.27倍，中部含量是下部的6.57倍。炮制后只有上部能檢測到IGF-1，其含量只有未炮制的5.7%。見表3。

表3 炮制前、后鹿茸不同部位IGF-1含量Table 3 The content of the IGF-1 in the velvet antler before and after processing （ng/mL）

3.4 炮制前、后鹿茸不同部位NGF含量

鮮鹿茸中NGF含量從上到下依次降低，上部是下部的5.9倍。炮制后只有上部和中部可以檢測到含量較低的NGF，上部含量只有炮制前的27.35%。見表4。

表4 炮制前、后鹿茸不同部位NGF含量Table 4 The content of the NGF in the velvet antler before and after processing.

4 討論

鹿茸被認為是一個天然的細胞因子庫，鹿茸生長因子在鹿茸的藥用功能中占有極其重要的地位，是鹿茸的主要藥效成分之一[4]。其中，認為比較重要、研究較多的生長因子有EGF、NGF、IGF-1等。EGF是強有力的促細胞分裂因子；NGF具有神經(jīng)元營養(yǎng)和促突起生長雙重生物學(xué)功能，促進鹿茸組織神經(jīng)的快速生長；IGF-1是胰島素樣生長因子家族中的重要成員，也是活性最強的成員，它與鹿茸的生長發(fā)育直接相關(guān)。因此，本研究選這3種比較重要的細胞因子進行研究。對梅花鹿鹿茸不同部位細胞因子的含量的研究目前未見報道，本研究提供的數(shù)據(jù)為梅花鹿鹿茸細胞因子的深入研究和利用奠定了基礎(chǔ)。

鹿茸的質(zhì)量控制一直是企業(yè)和市場比較關(guān)注的問題。傳統(tǒng)臨床經(jīng)驗已經(jīng)證明，鹿茸從上到下功效依次降低，作為商品的上部臘片和下部骨片差價很大[7]。結(jié)合鹿茸的組織結(jié)構(gòu)特點，本研究將鹿茸橫切為上、中、下3部分，分別對應(yīng)鹿茸增生區(qū)、成熟區(qū)和肥大區(qū)以及鈣化區(qū)，3種生長因子從上到下含量急劇降低，尖部含量最高。也有文獻報道，馬鹿茸中IGF-1含量具有相似的變化趨勢[13]。這些數(shù)據(jù)也進一步證明鹿茸中生長因子是鹿茸活性的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。反過來，鹿茸樣品中生長因子含量也可以作為質(zhì)量評價的依據(jù)之一。本研究中所用ELISA試劑盒中的一抗是根據(jù)人的EGF、NGF和IGF-1制備的。由于沒有鹿的相關(guān)因子的ELISA試劑盒，而人與鹿的這3個因子氨基酸序列存在較高的同源性，郝琳琳等[14]通過人的EFG、IGF-1、NGF抗體對鹿茸醇提、酸提多肽進行Western實驗，結(jié)果，這3個因子都可以檢測到。因此，選取人的相關(guān)生長因子的ELISA試劑盒是可行的。ELISA的檢測方法簡單、靈敏、易操作，用此法檢測鹿茸中生長因子的含量做為鹿茸質(zhì)量控制的方法有很大的開發(fā)潛力。

鹿茸作為動物角類，用白酒潤透切片的方式也是其傳統(tǒng)炮制方法之一。但目前，市售的鹿茸片大多還是采用相對簡便的沸水煮炸與風(fēng)干相結(jié)合的方法[15]。為盡可能保證初始樣品成分的一致性、減小實驗誤差，研究中將同一根鹿茸對稱縱切成2份，分別作為鮮品和用于炮制。本研究數(shù)據(jù)顯示，熱炸法炮制后鹿茸中可溶性蛋白含量降低，3種細胞因子含量明顯降低，由此可見，傳統(tǒng)熱炸法炮制工藝可能部分破壞鹿茸活性，有待改進。溫度對包括生長因子在內(nèi)的蛋白類活性成分影響較大，針對鹿茸活性成分中蛋白多肽類占較大比重（鹿茸中蛋白質(zhì)含量為50%～60%）的特點，已經(jīng)有多種鹿茸加工工藝的改進方法研究[6]。有報道認為，低溫凍干工藝能較好地保存鹿茸的活性，因此，建議生產(chǎn)上采用低溫加工工藝。

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