反向遺傳技術(shù)與豬口蹄疫O型、A型二價(jià)滅活疫苗

李永霞/中農(nóng)威特生物科技股份有限公司

反向遺傳學(xué)是相對(duì)于經(jīng)典遺傳學(xué)而言的。經(jīng)典遺傳學(xué)的認(rèn)知路線為由表及里，是從生物體自身的性狀、表型出發(fā)到它的遺傳物質(zhì)來(lái)研究生命的發(fā)生和發(fā)展規(guī)律。而反向遺傳學(xué)則與經(jīng)典遺傳學(xué)恰恰相反，是一條由里及表的認(rèn)知路線，其首先是獲得生物體基因組的全部序列，然后對(duì)靶基因有目的地進(jìn)行加工和修飾，如基因插入、基因缺失、基因置換及定點(diǎn)突變等，再按組成順序構(gòu)建含生物體必需元件的修飾基因組，讓其裝配出具有生命活性的個(gè)體，研究生物體基因組的結(jié)構(gòu)與功能，以確定這些變化對(duì)表型性狀的直接影響，與之相關(guān)的技術(shù)為反向遺傳技術(shù)。

反向遺傳技術(shù)在生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，且在疫苗研發(fā)方面已顯示出重要的作用。該技術(shù)的問(wèn)世和發(fā)展為生產(chǎn)合適的疫苗株提供了可能，其原因有以下幾個(gè)方面，第一：相比于傳統(tǒng)疫苗株的篩選方法，反向遺傳技術(shù)改造基因進(jìn)而獲得的疫苗株更直接且更合理；第二：該技術(shù)能夠消除那些非允許細(xì)胞系分離毒株可能帶來(lái)的污染或其他病原體；第三：通過(guò)操作質(zhì)粒，能夠改造影響病毒毒力的基因，去除那些致病因素，進(jìn)而提高疫苗及疫苗生產(chǎn)的安全性。疫苗免疫依然是防控大部分動(dòng)物疫病的最有效手段，反向遺傳技術(shù)的應(yīng)用為設(shè)計(jì)和改造疫苗發(fā)揮了巨大作用。

反向遺傳技術(shù)現(xiàn)已成功應(yīng)用于禽流感、新城疫、口蹄疫等畜禽重大疫病的疫苗研究中，除口蹄疫疫苗外具有代表性的產(chǎn)品有三例：一是重組禽流感病毒滅活疫苗(H5N1亞型，Re-1株)，2005年獲得一類新獸藥注冊(cè)證書（（2005）新獸藥證字3號(hào)）；二是利用新城疫LaSota弱毒疫苗反向遺傳系統(tǒng)，構(gòu)建表達(dá)不同H5高致病力禽流感病毒HA抗原的重組病毒，成功研制禽流感、新城疫重組二聯(lián)活疫苗（rL-H5株），2007年獲得一類新獸藥注冊(cè)證書（(2007)新獸藥證字03號(hào)）；三是重組新城疫病毒滅活疫苗（A-Ⅶ株），2014年獲得一類新獸藥注冊(cè)證書（（2014）新獸藥證字40號(hào)，農(nóng)業(yè)部公告第2169號(hào)），其為防控畜禽疫病做出了卓越的貢獻(xiàn)。本文主要介紹反向遺傳技術(shù)在研發(fā)口蹄疫疫苗中的應(yīng)用。

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一種急性、熱性、高度接觸傳染性，且可快速遠(yuǎn)距離傳播的動(dòng)物疫病。侵染對(duì)象是豬、牛、羊、駱駝等主要畜種及其他家養(yǎng)和野生偶蹄動(dòng)物，易感動(dòng)物多達(dá)70余種。發(fā)病動(dòng)物的主要癥狀是精神沉郁、流涎、跛行、臥地，近查可見口、鼻、蹄和母畜乳頭等無(wú)毛部位發(fā)生水皰，水皰破損后形成潰瘍或斑痂?？谔阋叩陌l(fā)病率高，可造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失和社會(huì)影響。該病為世界動(dòng)物衛(wèi)生組織法定報(bào)告的動(dòng)物傳染病，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物疫病。目前，口蹄疫仍然在世界許多地區(qū)流行，實(shí)踐證明有效的疫苗免疫能夠控制口蹄疫大范圍的暴發(fā)和流行。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織和泛美口蹄疫中心肯定滅活疫苗免疫是當(dāng)前防控口蹄疫的最有效手段。中國(guó)政府對(duì)口蹄疫的防控一直高度重視，有健全的組織機(jī)構(gòu)與防控體系，長(zhǎng)期堅(jiān)持實(shí)施 “預(yù)防為主、免疫和撲殺相結(jié)合”的綜合防控措施，取得了舉世公認(rèn)的成效。

反向遺傳技術(shù)在口蹄疫疫苗中的應(yīng)用起源于2009年A型口蹄疫Sea-97疫情。2009年，A型口蹄疫Sea-97毒株由東南亞跨區(qū)域傳播至中國(guó)、韓國(guó)、蒙古、俄羅斯、朝鮮等東亞和東北亞國(guó)家，引起大流行，全世界為之矚目。世界口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室利用國(guó)際疫苗毒株庫(kù)儲(chǔ)備疫苗株與之抗原匹配性試驗(yàn)，其匹配值均低于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)合適疫苗株可推薦。與此同時(shí)，國(guó)內(nèi)外有關(guān)疫苗研發(fā)單位對(duì)該流行毒分離株也開展了疫苗種毒馴化篩選工作，但都因病毒產(chǎn)量低、免疫效力差而沒(méi)有成功。

口蹄疫病毒為單股正鏈 RNA病毒，基因組全長(zhǎng)約 8500個(gè)核苷酸(nt) ，由5′端非編碼區(qū)(5′-UTR)、開放閱讀框( ORF)和 3′-UTR 及 Poly( A)尾巴組成。 5′-U TR長(zhǎng)約1200 nt，含有S片段、Poly(C)和IRES 等，并在其 5′末端連有一個(gè) VPg。ORF由L基因、P1 結(jié)構(gòu)蛋白基因、P2和P3非結(jié)構(gòu)蛋白基因以及起始密碼子和終止密碼子組成，長(zhǎng)約 6.5 kb，編碼一個(gè)大的聚合蛋白。此蛋白隨后被逐級(jí)降解為病毒所需的各個(gè)組分 L/L′，P1(1A、1B、1C和1D)、 P2(2A、2B和2C)和 P3(3A、3B、3C 和 3D)。3′U TR 長(zhǎng)約 92 nt。Poly(A)尾巴長(zhǎng)約100 nt。

疫苗研發(fā)團(tuán)隊(duì)通過(guò)全基因信息解讀發(fā)現(xiàn)，A型Sea-97毒株3'端非編碼區(qū)（3'UTR）莖環(huán)發(fā)生了突變，用單質(zhì)粒病毒拯救系統(tǒng)證實(shí)，該突變將導(dǎo)致病毒在細(xì)胞（BHK-21）內(nèi)的復(fù)制水平大幅度降低，從而解釋了田間分離的A型Sea-97毒株細(xì)胞繁殖力低難以馴化為疫苗毒的原因。其后，該團(tuán)隊(duì)利用高復(fù)制力型的3'UTR和3D基因構(gòu)建了制苗種毒拯救框架，同時(shí)對(duì)A型Sea-97毒株結(jié)構(gòu)蛋白P1基因進(jìn)行突變修飾，改變了影響病毒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的關(guān)鍵氨基酸編碼，并將其克隆至上述病毒拯救框架，制備出Sea-97株重組病毒Re-A/WH/09，其病毒抗原產(chǎn)量提高2.25～6.67倍，抗原穩(wěn)定性提升1倍以上，對(duì)A型Sea-97 G1分支毒（A/WH/09）和G2分支（A/GDMM/2013）病毒的匹配性高，抗原關(guān)系r值分別為0.94±0.12和0.68±0.06（OIE規(guī)定當(dāng)r≥0.3視為抗原匹配）。

Re-A/WH/09毒株不僅解決了A型口蹄疫Sea-97流行毒的防控問(wèn)題，同時(shí)也解決了世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）疫苗毒株庫(kù)缺少可與Sea-97流行毒匹配的疫苗株問(wèn)題。2013-2017年，被OIE口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室推薦使用。有力推動(dòng)了口蹄疫疫苗的科技進(jìn)步，已獲得了甘肅專利一等獎(jiǎng)（2015）和中國(guó)專利優(yōu)秀獎(jiǎng)（2016）。

由此可見，利用反向遺傳技術(shù)構(gòu)建疫苗種毒是口蹄疫疫苗創(chuàng)制技術(shù)的重大創(chuàng)新和發(fā)明，能夠解決常規(guī)技術(shù)難以解決的問(wèn)題，為繼續(xù)提升制苗種毒多種性能（如提升產(chǎn)能、誘導(dǎo)早期免疫應(yīng)答、延長(zhǎng)免疫保護(hù)期、降低和消除致病性和免疫抑制等）和創(chuàng)制更高效疫苗奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，將使我國(guó)的畜禽疫苗技術(shù)躍居國(guó)際領(lǐng)先水平。

在成功構(gòu)建A型疫苗種毒的基礎(chǔ)上，疫苗研發(fā)團(tuán)隊(duì)利用制苗種毒拯救框架對(duì)O型Mya-98病毒進(jìn)行了改造和提升。再通過(guò)L、5'UTR和P12A等基因修飾，減弱其致病性，制備出針對(duì)O/Mya-98株的重組病毒Re-O/MYA98/JSCZ/2013。該重組疫苗毒的病毒產(chǎn)量明顯提高，對(duì)家畜致病性減弱，抗原針對(duì)流行毒株，提高了疫苗生產(chǎn)效率、免疫效力和疫苗及疫苗生產(chǎn)的安全性。

由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所和中農(nóng)威特生物科技股份有限公司等單位聯(lián)合成功研制的豬口蹄疫O型、A型二價(jià)滅活疫苗（Re-O/MYA98/JSCZ/2013株+Re-A/WH/09株）已于2017年12月11日獲得“一類新獸藥注冊(cè)證書（證號(hào)：（2017）新獸藥證字56號(hào)）。中農(nóng)威特生物科技股份有限公司已于2018年2月23日獲得了豬口蹄疫O型、A型二價(jià)滅活疫苗（Re-O/MYA98/JSCZ/2013株+Re-A/WH/09株）的獸藥產(chǎn)品批準(zhǔn)文號(hào)，不日產(chǎn)品即可面市。豬口蹄疫O型、A型二價(jià)滅活疫苗（Re-O/MYA98/JSCZ/2013株+Re-A/WH/09株）是國(guó)內(nèi)外首例使用反向遺傳技術(shù)定向設(shè)計(jì)和優(yōu)化構(gòu)建疫苗種毒的豬用口蹄疫O型、A型二價(jià)滅活疫苗，本疫苗生產(chǎn)和推廣使用，對(duì)穩(wěn)定國(guó)內(nèi)O型口蹄疫疫情，防止豬A型口蹄疫疫情間歇性反彈，實(shí)現(xiàn)免疫無(wú)疫要求等方面具有重要意義。該疫苗的問(wèn)世，將徹底解決無(wú)豬用A型口蹄疫疫苗的歷史，有力地支撐了國(guó)家防控需求。對(duì)規(guī)模豬場(chǎng)和養(yǎng)殖戶來(lái)說(shuō)，是一場(chǎng)及時(shí)雨，不僅有了高效豬用口蹄疫O型、A型二價(jià)滅活疫苗，而且還得到了農(nóng)業(yè)部的官方許可。該疫苗具有以下優(yōu)勢(shì)：

（1）具有良好的免疫原性和免疫效力。重組毒株制備的疫苗免疫的宿主抗體應(yīng)答早且高。

（2）拓寬了疫苗種毒的抗原譜。通過(guò)構(gòu)建重組表位，拓寬抗原譜，提高交叉保護(hù)性，可有效防控目前我國(guó)現(xiàn)有A型和O型流行毒株。

（3）提高了抗原產(chǎn)能和穩(wěn)定性。制苗種毒Re-A/WH/09株和Re-O/MYA98/JSCZ/2013株在生產(chǎn)用懸浮BHK-21細(xì)胞上很好的生長(zhǎng)，抗原產(chǎn)能提高3～10倍。抗原穩(wěn)定性提高1～3倍。

（4）提高了生物安全性。重組制苗種毒的致病性減弱，從而降低了疫苗及疫苗生產(chǎn)的過(guò)程中生物安全風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，反向遺傳技術(shù)在口蹄疫疫苗的研發(fā)方面已取得了很大的突破，其是疫苗研制方面強(qiáng)有力的工具和手段，將會(huì)在此方面發(fā)揮更大的作用。