孫紅麗，楊繼輝，牛楠，朱明星，趙巍，宋熔

(1寧夏醫(yī)科大學(xué)，銀川750004；2中國人民解放軍第五醫(yī)院)

心臟對氧氣的需求較為敏感，缺氧會造成心肌細(xì)胞不可逆的損傷，因此，提高缺氧條件下心肌細(xì)胞的存活能力顯得尤為重要。研究顯示，核呼吸因子-1(NRF-1)可以改善細(xì)胞在缺氧條件下的存活能力[1]。NRF-1可以通過與過氧化物酶體增殖受體γ輔激活因子1α(PGC1α)結(jié)合，調(diào)節(jié)線粒體的功能，從而增強(qiáng)細(xì)胞呼吸能力及代謝水平[2]。因此，了解缺氧條件下NRF-1對心肌細(xì)胞的影響具有重要意義。2015年11月～2016年8月，我們構(gòu)建了NRF-1過表達(dá)的大鼠心肌細(xì)胞系，觀察缺氧條件下細(xì)胞增殖及凋亡水平的變化，為心血管系統(tǒng)疾病的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠心肌細(xì)胞H9C2和293T細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，感受態(tài)細(xì)胞JM109購自Promega公司。pCDH-Promoter-MCS-EF1-Puro慢病毒載體購自Invitrogen公司，包裝質(zhì)粒(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)購自SBI公司。TRIzol RNA提取試劑購自Invitrogen公司，限制性核酸內(nèi)切酶BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ購自Thermo公司，NRF-1兔單克隆抗體購自Abcam公司，鼠抗β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自中杉金橋公司，AnnexinⅤ-APC/7-ADD凋亡檢測試劑盒購自上海鈺博生物科技有限公司，PolyJet轉(zhuǎn)染試劑購自SignaGen公司。FACSAriaⅢ流式細(xì)胞分選儀購自BD公司，PCR擴(kuò)增儀購自BIO-RAD公司，CO2培養(yǎng)箱、缺氧用三氣培養(yǎng)箱、超高速離心機(jī)購自Thermo公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理 向H9C2細(xì)胞中加入完全培養(yǎng)液(10%胎牛血清+DMEM高糖培養(yǎng)基+1%雙抗)培養(yǎng)。將細(xì)胞分為NRF-1過表達(dá)組、空載體組和正常對照組。NRF-1過表達(dá)組、空載體組分別用NRF-1過表達(dá)慢病毒及空載體病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，正常對照組不做處理。將三組細(xì)胞置于缺氧用三氣培養(yǎng)箱中進(jìn)行缺氧培養(yǎng)(37 ℃、1% O2+5% CO2+94% N2)24 h。

1.3 細(xì)胞增殖情況觀察 采用實(shí)時無標(biāo)記分析(RTCA)技術(shù)。實(shí)驗(yàn)前校正E-plate8細(xì)胞培養(yǎng)板。取三組細(xì)胞，制成細(xì)胞密度為1×105/mL的單細(xì)胞懸液，取300 μL加入E-plate8細(xì)胞培養(yǎng)板中。按照RTCA的操作說明監(jiān)測缺氧6、12、24 h時的細(xì)胞增殖水平。

1.4 細(xì)胞凋亡情況觀察 采用流式細(xì)胞儀。取三組缺氧24 h時的細(xì)胞，制成細(xì)胞密度為3×105/mL的單細(xì)胞懸液，4 ℃離心5 min，棄上清，PBS洗滌，加入5 μL Binding buffer重懸細(xì)胞，加入5 μL AnnexinⅤ-APC和5 μL 7-ADD染液混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.5 細(xì)胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3) mRNA表達(dá)檢測 采用qRT-PCR法。取三組缺氧24 h時的細(xì)胞，加入TRIzol液提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，加入caspase-3引物及GAPDH引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。caspase-3上游引物:5′-TGACTGGAAAGCCGAAACT-3′，下游引物5′-GGGTGCGGTAGAGTAAGCAT-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃ 2 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s共30個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。用2-ΔΔct法計算目的基因相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖水平比較 缺氧6 h時，正常對照組、NRF-1過表達(dá)組、空載體組細(xì)胞增殖水平分別為1.08±0.02、0.96±0.41、0.81±0.02，組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；缺氧12 h時，正常對照組、NRF-1過表達(dá)組、空載體組細(xì)胞增殖水平分別為1.07±0.01、1.48±0.12、0.96±0.03，NRF-1過表達(dá)組高于正常對照組和空載體組(P均<0.05)；缺氧24 h時，正常對照組、NRF-1過表達(dá)組、空載體組細(xì)胞增殖水平分別為0.99±0.11、1.00±0.01、0.99±0.01，組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。

2.2 各組細(xì)胞凋亡率比較 缺氧24 h時，正常對照組、NRF-1過表達(dá)組、空載體組細(xì)胞凋亡率分別為39.13%±0.59%、17.17%±0.25%、31.50%±0.90%。與正常對照組和空載體組比較，NRF-1過表達(dá)組細(xì)胞凋亡率均降低(P均<0.05)。

2.3 各組細(xì)胞中caspase-3 mRNA表達(dá)比較 缺氧24 h時，正常對照組、NRF-1過表達(dá)組、空載體組細(xì)胞中caspase-3 mRNA的表達(dá)水平分別為0.85±0.14、0.48±0.11、0.63±0.08，NRF-1過表達(dá)組低于正常對照組(P<0.05)，NRF-1過表達(dá)組與空載體組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

各種應(yīng)激造成的心肌細(xì)胞損傷是心血管系統(tǒng)疾病發(fā)生的重要病因，而缺氧造成的心肌細(xì)胞凋亡是心肌細(xì)胞損傷的重要因素[3]。研究發(fā)現(xiàn)，抑制心肌細(xì)胞凋亡可有效預(yù)防心力衰竭的發(fā)生[4]。因此，尋找能夠抑制缺氧條件下心肌細(xì)胞凋亡的方法對研究心血管疾病具有重要意義。目前基因治療已被廣泛應(yīng)用于多種疾病的研究中，尤其在心血管疾病的研究中具有很大的發(fā)展空間。NRF-1最初是在研究線粒體細(xì)胞色素C的表達(dá)中發(fā)現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其通過參與線粒體的生物合成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等過程來調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長代謝[5～7]。研究顯示，NRF-1基因敲除鼠在妊娠晚期會造成胚胎致死，表明NRF-1基因在細(xì)胞的生長發(fā)育中是必不可少的[8]。

NRF-1在一些應(yīng)激條件下可降低細(xì)胞凋亡水平，同時也能提高細(xì)胞呼吸能力，增強(qiáng)細(xì)胞的存活能力[4]。但在心肌細(xì)胞中，尤其在缺氧條件下NRF-1對心肌細(xì)胞損傷的影響報道甚少。有研究顯示，在缺血性心臟病、心力衰竭、心律失常等疾病中，NRF-1表達(dá)水平下降[9]。本研究結(jié)果顯示，在缺氧條件下，NRF-1過表達(dá)組細(xì)胞增殖水平較正常對照組和空載體組升高，細(xì)胞凋亡水平較正常對照組和空載體組下降，表明NRF-1對缺氧引起的心肌細(xì)胞凋亡具有一定的抑制作用。

caspase-3是caspase家族中的成員，正常細(xì)胞中caspase-3處于非活化的酶原狀態(tài)，凋亡程序一旦開始，caspase-3由內(nèi)源性(線粒體)或外源性(死亡配體)途徑活化，隨后發(fā)生凋亡蛋白酶的層疊級聯(lián)反應(yīng)，從而發(fā)生不可逆的凋亡[10～12]。有研究報道，心臟在缺血再灌注損傷時caspase-3表達(dá)水平升高[13，14]。本研究結(jié)果顯示，在缺氧條件下，NRF-1過表達(dá)組caspase-3 mRNA表達(dá)水平降低，表明NRF-1可能與缺氧條件下caspase-3活化的凋亡有關(guān)。

綜上所述，NRF-1在心肌細(xì)胞的增殖過程中發(fā)揮重要作用,在缺氧條件下NRF-1基因?qū)9C2存活能力具有重要影響，其機(jī)制可能是通過抑制細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。本研究結(jié)果表明，NRF-1基因在心血管系統(tǒng)疾病中具有重要的作用，為今后心血管系統(tǒng)疾病的基因治療提供了一個候選基因。