金正勛，韓云飛，王海微，朱 琳，曲 悅，何沈雨，楊 玲，王 珊，張忠臣

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030）

作物生長(zhǎng)發(fā)育過程干物質(zhì)形成約90%來自光合作用同化產(chǎn)物[1]。禾谷類作物抽穗結(jié)實(shí)期間，光合器官葉片衰老，光合作用下降，干物質(zhì)積累減少。植物葉片衰老是一個(gè)復(fù)雜而高度有序并伴隨大分子物質(zhì)降解過程，是植物在進(jìn)化過程中適應(yīng)環(huán)境重要表現(xiàn)。早期有關(guān)植物葉片衰老的研究，主要集中在植物整株、器官水平上形態(tài)解剖特征、衰老生理代謝特征變化及衰老類型劃分指標(biāo)等方面。20世紀(jì)60年代初至80年代末，植物衰老研究深入到組織、細(xì)胞和亞細(xì)胞水平。從80年代末起，隨現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)如體外翻譯技術(shù)、cDNA差異顯示、差減雜交、反義RNA技術(shù)及功能基因組研究等在衰老生物學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，植物葉片衰老分子機(jī)制逐漸揭示[2-4]。研究者從不同角度對(duì)植物衰老機(jī)理開展研究，提出有關(guān)植物衰老機(jī)制假說，包括基因調(diào)控說、光碳失衡說、營養(yǎng)失衡說、激素平衡說及自由基傷害說等[5-7]。

氮素是植物需求量最大礦質(zhì)營養(yǎng)元素，是植物個(gè)體和生態(tài)系統(tǒng)中最常見生長(zhǎng)限制因子，也是水稻生長(zhǎng)發(fā)育必不可少營養(yǎng)元素之一，對(duì)水稻生長(zhǎng)和光合作用及產(chǎn)量與品質(zhì)起重要調(diào)控作用。氮肥施用量不足導(dǎo)致葉肉細(xì)胞葉綠體結(jié)構(gòu)性差、細(xì)胞碳水化合物積累少、營養(yǎng)體氮素再分配比率失衡，引起葉片衰老；過量供氮?jiǎng)t葉片氮代謝過旺、硝酸還原酶活性過高，消耗大量碳水化合物，老葉無法獲得充足糖供應(yīng)而提前脫落，同時(shí)葉肉細(xì)胞葉綠體片層結(jié)構(gòu)膨脹，維管束細(xì)胞淀粉粒大量消耗，葉片因葉綠素含量下降、光合能力降低出現(xiàn)早衰[8]，因此氮肥施用不足或過量，均導(dǎo)致葉片提前衰老。除氮肥施用量外，不同氮肥施用技術(shù)也與后期葉片衰老密切相關(guān)，適當(dāng)增加中后期追肥施用量可有效延緩小麥旗葉衰老進(jìn)程[9]。

水稻籽粒灌漿所需碳水化合物主要來自抽穗后葉片光合作用，理論上延緩一天葉片衰老可增產(chǎn)約2%[10]，實(shí)測(cè)可增產(chǎn)約1%[11]，延緩后期葉片衰老是水稻優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)栽培中心環(huán)節(jié)。因此，本試驗(yàn)選用兩個(gè)不同類型水稻品種，研究蘗穗氮肥追施比例對(duì)水稻灌漿成熟期葉片衰老相關(guān)化合物及酶活性和基因表達(dá)量影響，旨在闡明氮素營養(yǎng)對(duì)水稻葉片衰老的調(diào)控機(jī)理，為水稻優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)減肥栽培技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試品種與試驗(yàn)處理

本試驗(yàn)選用穗數(shù)型高產(chǎn)品種龍稻11號(hào)和穗重型超級(jí)稻品種松粳9號(hào)，于2016年在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院作盆栽試驗(yàn)。盆的長(zhǎng)×寬×高為0.6 m×0.4 m×0.4 m，4月4日播種，大缽體盤育苗，每孔播3粒催芽籽，大棚旱育秧管理，5月15日選擇葉齡相同，長(zhǎng)勢(shì)相近秧苗插秧，每盆插8穴，每穴3棵，正常水管理。

施肥量為純氮6 kg·666.7 m-2，以盆表面積折算為每盆施肥量。設(shè)4個(gè)施肥處理，分別以T1、T2、T3和T4表示（見表1），N：P2O5：K2O=1∶0.5∶1，每個(gè)處理3盆?；试诓逖砬熬鶆蚴┤牒蟪浞?jǐn)嚢?.2 m土層，分蘗肥在第5片葉完全展開時(shí)施入，穗肥在倒二葉展開約一半時(shí)施入。

1.2 取樣方法

以穗部抽出葉鞘3 cm為基準(zhǔn)掛牌標(biāo)記抽穗日期，分別在抽穗后10、15、20、25、30 d取劍葉中部最寬部位5 cm，迅速液氮處理，隨后裝入密封袋保存于-80℃冰箱備用。

表1 施肥處理方法Table1 Fertilization treatment method

1.3 葉片全氮、丙二醛及葉綠素含量測(cè)定

分別用硫酸-過氧化氫消煮凱氏定氮法和TBA法測(cè)定葉片全氮含量和丙二醛含量[12-13]，96%乙醇提取法測(cè)定葉綠素含量[13]，每個(gè)處理3次重復(fù)，取平均值。

1.4 酶活性測(cè)定

分別用NBT法和愈創(chuàng)木酚法測(cè)定葉片SOD和POD活性[13]，每個(gè)處理3次重復(fù)，取平均值。

1.5 基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量測(cè)定

查找相關(guān)文獻(xiàn)獲基因登錄號(hào)，經(jīng)多重比對(duì)從水稻基因庫獲基因定位區(qū)域，使用Primer 5.0及NCBI內(nèi)Primer BLAST功能，在基因保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)高特異性Actin內(nèi)參基因和Rubisco同工型基因引物序列（見表 2）。選用 NOVA?Taq SYBR?Green qPCR Premix（NOVA，愚公生命科技有限公司，江蘇連云港）定量試劑盒及 Roche Light CyclerTM熒光定量PCR儀，以Actin基因作為內(nèi)參基因，采用Delte-DelteCt法分析基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量。

1.6 數(shù)據(jù)分析

表2 RT-qPCR反應(yīng)引物設(shè)計(jì)Table2 Design of RT-qPCR reaction primer

采用SPSS和Excel作數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施肥處理對(duì)灌漿過程中水稻葉片全氮含量影響

由表3可知，灌漿過程中水稻葉片全氮含量變化在2個(gè)品種間存在差異，穗重型品種松粳9號(hào)隨灌漿進(jìn)程葉片全氮含量先升高，抽穗15 d達(dá)峰值，其后迅速降低，抽穗20 d開始緩慢降低，呈單峰曲線變化，穗數(shù)型品種龍稻11號(hào)自抽穗10 d一直呈緩慢下降趨勢(shì)，抽穗20 d前兩個(gè)品種間葉片全氮含量差異較大，松粳9號(hào)全氮含量峰值顯著高于龍稻11號(hào)，抽穗20 d后兩品種間差異較小。說明灌漿前期葉片氮濃度和轉(zhuǎn)移速度存在顯著基因型差異，超級(jí)稻品種葉片氮濃度高于普通高產(chǎn)品種。

就灌漿不同時(shí)期處理間葉片全氮含量而言，隨穗肥施氮比例增加，灌漿各時(shí)期葉片全氮含量供試兩品種均顯著或略升高，葉片全氮含量順序?yàn)門1＞T2＞T3＞T4，穗重型品種松粳9號(hào)在抽穗15 d時(shí)T1處理葉片全氮含量分別較T2、T3及T4處理高1.09、1.11和1.19倍，抽穗30 d時(shí)T1與T2處理間差異不顯著，較T3和T4處理分別高1.07和1.17倍；穗數(shù)型品種龍稻11號(hào)在抽穗10 d時(shí)T1與T2處理間差異不顯著，但顯著高于T3和T4處理1.05倍和1.08倍，抽穗30 d時(shí)T1處理分別較T2、T3及T4處理高1.06、1.14和1.19倍。說明減少分蘗肥施氮量，增加穗肥施氮量可顯著提高灌漿各時(shí)期葉片全氮含量。

由表3可知，供試兩個(gè)品種在灌漿過程中葉片含氮量最高衰減率，因品種類型和施肥處理不同而異，超級(jí)稻品種松粳9號(hào)最高衰減率為46.98%～51.39%，龍稻11號(hào)為26.25%～32.79%，隨穗肥施氮比例增加，葉片全氮含量最高衰減率逐漸下降，順序?yàn)門1＜T2＜T3＜T4，處理間差異顯著，說明減少分蘗肥施氮量，增加穗肥施氮量可顯著抑制葉片氮濃度衰減速度，維持葉片較高氮濃度。

表3 灌漿不同時(shí)期施肥處理間水稻葉片全氮含量比較Table3 Comparison of total nitrogen content of rice leaves in fertilization treatments during different grouting period (mg·g-1)

2.2 不同施肥處理對(duì)灌漿過程中水稻葉片葉綠素含量影響

表4 灌漿不同時(shí)期施肥處理間水稻葉片葉綠素a含量比較Table4 Comparison of chlorophyll a content of rice leavesin fertilization treatments during different grouting period (mg·g-1)

表5 灌漿不同時(shí)期施肥處理間水稻葉片葉綠素b含量比較Table5 Comparison of chlorophyll bcontent of riceleaves in fertilization treatments during different grouting period (mg·g-1)

結(jié)果見表4～5。

由表4～5可知，供試兩品種及不同施肥處理葉片葉綠素a和b含量在灌漿過程中均逐漸下降，但兩品種和不同施肥處理間葉片葉綠素a和b含量下降速率差異顯著，中熟穗數(shù)型品種龍稻11號(hào)下降速率顯著高于晚熟穗重型超級(jí)稻品種松粳9號(hào)，隨穗肥施氮量減少葉片葉綠素a、b含量下降速率增加，說明增加穗肥施氮量可抑制葉片葉綠素含量下降。

灌漿各時(shí)期葉片葉綠素a和b含量供試兩品種均隨分蘗肥施氮量減少和穗肥施氮量增加而逐漸上升，不同施肥處理間差異顯著，葉綠素a和b含量順序?yàn)門1＞T2＞T3＞T4。葉片葉綠素a含量下降幅度，穗重型超級(jí)稻品種松粳9號(hào)T1處理抽穗30 d較抽穗10 d下降31.60%，T2處理下降38.85%，T3處理下降43.15%，T4處理下降47.28%，穗數(shù)型品種龍稻11號(hào)T1處理抽穗30d較抽穗10d下降45.19%，T2處理下降54.75%，T3處理下降61.69%，T4處理下降62.5%；葉綠素b含量下降幅度，松粳9號(hào)T1處理抽穗30 d較10 d下降31.45%、T2處理下降37.09%、T3處理下降41.61%、T4處理下降49.32%，龍稻11號(hào)T1處理下降48.23%、T2下降50.82%、T3下降51.67%、T4處理下降53.85%。說明減少分蘗肥施氮量和增加穗肥施氮量可顯著提高灌漿過程中葉片葉綠素a和b含量，且減緩葉綠素降解幅度。

2.3 不同施肥處理對(duì)灌漿過程中水稻葉片丙二醛含量影響

由表6可知，兩個(gè)品種及不同施肥處理葉片MDA含量在灌漿過程中均逐漸上升。隨分蘗肥施氮量減少和穗肥施氮量增加，在灌漿各時(shí)期葉片MDA含量逐漸降低，不同施肥處理間差異顯著，MDA含量順序?yàn)門4＞T3＞T2＞T1。穗重型品種松粳9號(hào)T4處理在抽穗10 d時(shí)分別較T1、T2和T3處理高2.03、1.51和1.11倍，抽穗后30d時(shí)分別高1.63、1.38和1.15倍，穗數(shù)型品種龍稻11號(hào)T4處理在抽穗10 d時(shí)分別較T1、T2和T3處理高1.79、1.49和1.15倍，抽穗30 d時(shí)分別高1.39、1.21和1.13倍。說明在灌漿過程中隨著葉片衰老MDA含量逐漸升高，增加穗肥施氮量可顯著抑制灌漿過程中葉片MDA含量升高。

表6 灌漿不同時(shí)期施肥處理間水稻劍葉MDA含量比較Table6 Comparison of MDA content of rice sword leaves in fertilization treatments during different grouting period (U·g-1)

表7 灌漿不同時(shí)期施肥處理間水稻劍葉SOD活性比較Table7 Comparison of SOD activity of rice sword leaves in fertilization treatments during different grouting period (U·g-1)

2.4 不同施肥處理對(duì)灌漿過程中水稻葉片SOD和POD活性影響

由表7～8可知，供試兩品種及不同施肥處理葉片SOD和POD活性在灌漿過程中均逐漸下降。隨分蘗肥施氮量減少和穗肥施氮量增加，在灌漿各時(shí)期葉片SOD和POD活性兩品種逐漸升高，不同施肥處理間差異顯著，SOD和POD活性順序?yàn)門1＞T2＞T3＞T4。與抽穗后10 d相比，抽穗后30d SOD活性下降幅度，穗重型超級(jí)稻品種松粳9號(hào)T1及T2為40.5%，T3處理為45.7%，T4處理為50.0%，穗數(shù)型品種龍稻11號(hào)的T1處理為68.4%，T2處理為69.5%，T3處理為72.5%，T4處理為73.1%；POD活性下降幅度，穗重型超級(jí)稻品種松粳9號(hào)T1處理為66.4%，T2處理為69.3%，T3處理為71.0%，T4處理為70.9%，穗數(shù)型品種龍稻11號(hào)T1處理為62.8%，T2處理為73.7%，T3處理為80.3%，T4處理為82.0%。說明灌漿過程中不同類型品種葉片SOD和POD活性下降速度差異顯著，減少分蘗肥施氮量和增加穗肥施氮量可顯著提高葉片SOD和POD活性，且減緩酶活性下降幅度。

表8 灌漿不同時(shí)期施肥處理間水稻劍葉POD活性比較Table8 Comparison of POD activity of rice sword leaves in fertilization treatments during different grouting period (U·g-1)

2.5 不同施肥處理對(duì)灌漿過程中水稻葉片Rubisco基因家族mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)量影響

由表9～10可知，灌漿過程中供試兩品種及不同施氮處理葉片OsRBCL和OsRBCS4基因mRNA表達(dá)量變化動(dòng)態(tài)基本一致，隨灌漿進(jìn)程先升高，達(dá)峰值后逐漸降低單峰曲線變化，峰值均出現(xiàn)在抽穗后15 d。就灌漿不同時(shí)期處理間基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量而言，隨分蘗肥施氮量減少和穗肥施氮量增加，供試兩品種在灌漿各時(shí)期葉片OsRBCL和OsRBCS4基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量均顯著上調(diào)，表達(dá)量順序?yàn)門1＞T2＞T3＞T4。但處理間高轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平持續(xù)時(shí)間差異顯著。葉片OsRBCL基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量維持高表達(dá)水平時(shí)間，穗重型超級(jí)稻品種松粳9號(hào)和龍稻11號(hào)T1處理為抽穗后10～25 d，T2和T3處理為抽穗后10～20 d，T4處理為在抽穗后10～15 d。與抽穗后15 d表達(dá)量峰值相比，抽穗后30 d表達(dá)量下降幅度松粳9號(hào)T1處理為40.3%，T2處理為41.8%，T3處理為45.1%，T4處理為53.9%，龍稻11號(hào)下降幅度T1處理為29.3%，T2處理為38.7%，T3處理為36.7%，T4處理為49.5%，但抽穗后30 d松粳9號(hào)T1處理表達(dá)量分別較T2、T3及T4處理上調(diào)1.17、1.34和1.77倍，龍稻11號(hào)T1處理表達(dá)量分別較T2、T3及T4處理上調(diào)1.21、1.33和1.74倍。

與抽穗后15 d OsRBCS4基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量相比，抽穗后30 d松粳9號(hào)下降幅度T1處理為31.6%，T2處理為31.1%，T3處理為34.3%，T4處理為36.0%，龍稻11號(hào)下降幅度T1處理為40.9%，T2處理為41.4%，T3處理為41.7%，T4處理為51.4%，但抽穗后30 d松粳9號(hào)T1處理表達(dá)量分別較T2、T3及T4處理上調(diào)1.05、1.18、1.29倍，龍稻11號(hào)T1處理較T2、T3及T4處理上調(diào)1.19、1.33、1.73倍。

由表11～12可知，兩品種及不同施肥處理OsRBCS2和OsRBCS3基因mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)量在抽穗后10～30 d逐漸下降，隨分蘗肥施氮量減少和穗肥施氮量增加，OsRBCS2和OsRBCS3基因mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)量隨之上調(diào)，其表達(dá)量順序?yàn)門1＞T2＞T3＞T4，處理間差異顯著。與抽穗后10 d OsRBCS2基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量相比，抽穗后30 d表達(dá)量下降幅度松粳9號(hào)T1處理為65.0%，T2處理為68.5%，T3處理為68.3%，T4處理為72.0%，龍稻11號(hào)T1處理為45.4%，T2處理為46.5%，T3處理為48.2%，T4處理為51.9%，但抽穗后30 d松粳9號(hào)T1處理表達(dá)量分別較T2、T3及T4處理上調(diào)1.23、1.32、1.55倍，龍稻11號(hào)T1處理較T2、T3及T4處理上調(diào)1.07、1.17、1.32倍。

表9 灌漿不同時(shí)期施肥處理間OsRBCL基因mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)量比較Table9 Comparison of OsRBCL mRNA transcript expression quantity in fertilization treatments during different grouting period

表10 灌漿不同時(shí)期施肥處理間OsRBCS4基因mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)量比較Table10 Comparison of OsRBCS4 mRNA transcript expression quantity in fertilization treatments during different grouting period

表11 灌漿不同時(shí)期施肥處理間OsRBCS2基因mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)量比較Table11 Comparison of OsRBCS2 mRNA transcript expression quantity in fertilization treatments during different grouting period

與抽穗后10 d OsRBCS3基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量相比，抽穗后30 d表達(dá)量下降幅度松粳9號(hào)T1處理為55.6%，T2處理為56.2%，T3處理為57.6%，T4處理為58.3%，龍稻11號(hào)T1處理為44.8%，T2處理為45.6%，T3處理為52.0%，T4處理為54.1%，但抽穗后30 d松粳9號(hào)T1處理表達(dá)量分別較T2、T3及T4處理上調(diào)1.23、1.42、1.65倍，龍稻11號(hào)T1處理較T2、T3及T4處理上調(diào)1.11、1.32、1.45倍。

隨灌漿進(jìn)程葉片Rubisco大亞基和小亞基基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量逐漸下降，減少分蘗肥施氮量和增加穗肥施氮量顯著提高灌漿過程中葉片Rubisco大亞基和小亞基基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量，減緩基因表達(dá)量下降幅度并延長(zhǎng)基因上調(diào)表達(dá)時(shí)間，灌漿后期仍然維持較高水平基因表達(dá)量。

表12 灌漿不同時(shí)期施肥處理間OsRBCS3基因mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)量比較Table12 Comparison of OsRBCS3 mRNA transcript expression quantity in fertilization treatments during different grouting period

表13 全氮含量與其他指標(biāo)間相關(guān)系數(shù)Table13 Correlation coefficient between total nitrogen content and other indexes

2.6 葉片全氮含量與其他指標(biāo)間相關(guān)分析

根據(jù)供試兩品種和不同處理數(shù)據(jù)估算葉片全氮含量與葉綠素含量、丙二醛含量及SOD和POD活性和Rubisco家族基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量間相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表13。

由表13可知，葉片全氮含量與丙二醛（MDA）含量間呈極顯著負(fù)相關(guān)，與葉綠素a、b含量、SOD和POD活性及Rubisco家族基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量間均呈極顯著正相關(guān)。說明增加葉片含氮量顯著抑制丙二醛含量升高，同時(shí)顯著提高葉綠素a、b含量、SOD和POD活性及Rubisco家族基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量。

3 討論與結(jié)論

葉片衰老是葉片生長(zhǎng)后期由植株內(nèi)部因素和外部環(huán)境共同調(diào)控高度有序過程（Thimanna，1980），是植物細(xì)胞程序化死亡（Programmed cell death，PCD）一種類型[14-15]。植物衰老時(shí)光合色素（葉綠素、葉黃素和類胡蘿卜素）降解速率加快，植株葉片黃化。與未衰老葉片相比，衰老葉片葉綠體間質(zhì)破壞，類囊體膨脹、裂解，嗜餓體數(shù)目增多、體積加大，葉綠素含量和光合速率顯著降低[16]。衰老時(shí)細(xì)胞內(nèi)自由基產(chǎn)生和清除平衡破壞，自由基積累量增多，由此誘發(fā)或加劇細(xì)胞膜脂過氧化。SOD、POD及CAT是清除活性氧關(guān)鍵酶[17-18]。研究發(fā)現(xiàn)，葉片衰老過程中植物體內(nèi)保護(hù)酶系統(tǒng)，如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）和谷朧甘膚還原酶（GSH）等及一些小分子抗氧化物質(zhì)在葉片衰老中活性和數(shù)量降低，細(xì)胞膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量增多[19-20]。水稻開花后葉片SOD活性降低，MDA含量上升，與此同時(shí)，Rubisco活性顯著下降[21]。在衰老過程中，細(xì)胞內(nèi)O2-和H2O2含量增加，二者結(jié)合通過哈伯韋斯反應(yīng)產(chǎn)生OH-，造成植物細(xì)胞膜氧化破裂，破壞光合結(jié)構(gòu)，植物體生理功能衰退[22]。因此為提升葉片光合效率，需降低碳氮比，及時(shí)清除活性氧，保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)不被破壞。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨籽粒灌漿進(jìn)程水稻葉片全氮含量和葉綠素a、b含量及葉片SOD和POD活性、Rubisco家族基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量等均逐漸下降，MDA含量升高。

Rubisco是決定C3植物光合碳代謝方向和效率關(guān)鍵酶。Rubisco含量、RuBPCase總活性和初始活性與光合速率呈正相關(guān)，葉片老化過程中伴隨光合速率降低和RuBPCase活性下降[23]。Parry等研究指出，Rubisco基因表達(dá)量與Rubisco羧化酶活性呈顯著正相關(guān)，提升其活性可增加同化產(chǎn)物量[24]。葉綠素a、b是綠色植物主要光合色素，葉綠素降解出現(xiàn)葉片黃化，影響葉片光合效率和光合產(chǎn)物。因此，減輕或緩降灌漿過程中上述與衰老相關(guān)內(nèi)含物或酶活性和基因表達(dá)量，是延長(zhǎng)葉片壽命、提高光合效率并增加光合產(chǎn)物關(guān)鍵。

提高葉片氮濃度，不僅在一定程度上改善葉片光合機(jī)構(gòu)及其性能，維持葉片較高光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）潛在活性和PSⅡ光化學(xué)最大效率，提高中下部葉片的光合速率[25-26]，且水稻體內(nèi)通過根系吸收NH+4及衰老葉片蛋白質(zhì)分解形成NH+4，均通過GS，GOGAT等一系列酶催化作用轉(zhuǎn)化為葉綠素合成前提物質(zhì)5-氨基乙酰丙酸，合成葉綠素[27]。張榮銑等認(rèn)為葉綠素含量緩降期為光合功能可逆衰退期，速降期為光合功能不可逆衰退期[28]。通過施加氮肥，延長(zhǎng)葉綠素緩降期及光合速率高值持續(xù)期。對(duì)水稻、小麥研究發(fā)現(xiàn)，施用氮肥延緩植株葉片衰老，在較大程度上是改善細(xì)胞活性氧清除系統(tǒng)能力、減輕細(xì)胞膜脂過氧化程度之果[29-30]。肖凱等在小麥研究中發(fā)現(xiàn)，小麥旗葉抽出后，適當(dāng)增施氮肥可保護(hù)SOD、CAT等活性氧清除系統(tǒng)[31]。朱方旭等研究表明，灌漿期間增施氮肥可提升Rubisco家族各基因表達(dá)量[32]。高玲等研究結(jié)果表明，抽穗期施氮肥可提高小麥旗葉光合速率、全氮與Rubisco含量，蛋白水解酶活力下降[33]。由本試驗(yàn)結(jié)果可知，葉片全氮含量與丙二醛（MDA）含量間呈極顯著負(fù)相關(guān)，與葉綠素a、b含量、SOD和POD活性及Rubisco家族基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量間均呈極顯著正相關(guān)。減少分蘗肥施氮量和增加穗肥施氮量可顯著提高灌漿各時(shí)期葉片全氮含量和葉綠素a、b含量及葉片SOD和POD活性、Rubisco家族基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量，顯著抑制葉片MDA含量升高和葉片氮濃度衰減速度及葉綠素和酶活性降解速度與幅度，減緩Rubisco家族基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量下降幅度并延長(zhǎng)基因上調(diào)表達(dá)時(shí)間。而且，增大施氮量可增加綠色葉面積及光能吸收，提高單位葉面積凈光合速率，延長(zhǎng)葉片光合功能期[34]。因此，減少分蘗肥施氮量，增加穗肥施氮量，提高和維持灌漿成熟期葉片氮濃度，降低與葉片衰老相關(guān)內(nèi)含物和酶活性及基因表達(dá)量，防止葉片衰老、延長(zhǎng)葉片壽命，提高光合效率并增加光合產(chǎn)物，是水稻高產(chǎn)及優(yōu)質(zhì)的重要調(diào)控措施。

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