王傲雪，劉思源

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，哈爾濱 150030）

鈣離子作為第二信使，廣泛參與植物生長發(fā)育過程并調(diào)控外界環(huán)境脅迫刺激反應(yīng)[1]。細胞質(zhì)中鈣離子濃度瞬時升高可能因生理過程所致，包括非生物脅迫刺激（如高溫、低溫、鹽、干旱或滲透脅迫）、病原防御、離子平衡、生長發(fā)育等[2-3]，改變細胞內(nèi)鈣離子時空分布[4]。植物對鈣信號解碼首先從鈣離子感受器開始，特異刺激產(chǎn)生鈣信號可被特異鈣離子感受器感知，CBL是植物中一種鈣離子感受器，可與CIPK特異互作，將鈣信號傳遞，在植物中產(chǎn)生理化反應(yīng)[5]。

Veronica等和Lee等分析擬南芥CIPK蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，擬南芥CIPK蛋白均在N端包含激酶結(jié)構(gòu)域，C端包含調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，其中C端調(diào)節(jié)域包括NAF結(jié)構(gòu)域（與CBL蛋白特異結(jié)合）和PPI結(jié)構(gòu)域（與PP2C互作）[6-7]。在無CBL蛋白結(jié)合情況下，CIPK蛋白無激酶活性，因CIPK的C端調(diào)節(jié)域抑制N端激酶域。一旦CIPK蛋白與CBL蛋白結(jié)合，CIPK C端調(diào)節(jié)域移動使激酶域顯露而活化[8]。

近年來，植物中發(fā)現(xiàn)CBL-CIPK參與高鹽、低溫、干旱、營養(yǎng)元素、氧化脅迫、高Ph脅迫、激素信號應(yīng)答等多種環(huán)境因素刺激引發(fā)的生理變化。其中CBL-CIPK參與鹽脅迫SOS途徑主要包括SOS1（Na+/H+antipoter）、SOS2（AtCIPK24）、SOS3（AtCBL4）3個功能蛋白，在高鹽環(huán)境下SOS2和SOS3結(jié)合并磷酸化激活SOS1，SOS1從細胞質(zhì)吸收質(zhì)子排除鈉，維持細胞內(nèi)低鹽環(huán)境[9]。除此，其他非生物脅迫過程中CIPK基因也發(fā)揮重要作用，擬南芥中AtCBL9-AtCIPK3和AtCBL1-AtCIPK7信號通路參與低溫誘導(dǎo)調(diào)控[10-11]；水稻中OsCIPK3可被低溫誘導(dǎo)，上調(diào)表達[12]；小麥中TaCBL4、TaCBL9、TaCIPK7、TaCIPK15、TaCIPK24、TaCIPK32參與誘導(dǎo)植物低溫脅迫應(yīng)答[13]。Yong等通過表達擬南芥CBL5基因提高其干旱脅迫抗性[14]；水稻中過表達OsCIPK12后可增強其耐旱性[12]。

番茄隨基因組公布已鑒定YABBY、bZIP、GRF等功能基因家族[15-17]，但CIPK蛋白家族尚未報道。本研究基于番茄全基因組數(shù)據(jù)、擬南芥CIPK基因家族氨基酸序列及生物信息學(xué)常用軟件，在全基因組范圍內(nèi)，鑒定番茄CIPK基因家族成員序列并預(yù)測生物信息學(xué)信息及作用，為揭示該家族成員生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 番茄CIPK基因家族的鑒定及生物信息學(xué)分析

利用現(xiàn)有番茄注釋基因的核苷酸序列（https://solgenomics.net/）與擬南芥CIPK氨基酸序列（https://www.arabidopsis.org/）作tBLASTn比對（E-value＜1e-10,identity＞50%），去除重復(fù)，篩選CIPK候選基因。利用Prosite網(wǎng)站（http://prosite.expasy.org/）鑒定候選CIPK蛋白結(jié)構(gòu)域，挑選同時具有NAF和PPI結(jié)構(gòu)域蛋白序列。鑒定番茄CIPK基因家族成員后用ExPASy Proteomics Sever網(wǎng)站（http://expasy.org/）預(yù)測所有番茄CIPK蛋白氨基酸序列蛋白質(zhì)長度、分子質(zhì)量、等電點。

1.2 番茄CIPK基因家族系統(tǒng)進化分析

為探究CIPK基因家族內(nèi)進化關(guān)系，用MEGA軟件，采用鄰接法（Neighbor-Joining），將番茄、擬南芥、楊樹、小麥、水稻、加拿大油菜CIPK基因家族分析合并系統(tǒng)進化，校驗參數(shù) 1 000次重復(fù)。

1.3 番茄CIPKs基因結(jié)構(gòu)分析

提取番茄CIPK基因CDS序列及對應(yīng)基因組序列信息，運用GSDS工具分析基因結(jié)構(gòu)，繪制番茄CIPK基因家族外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)圖。

1.4 番茄CIPK基因家族順式作用元件分析

分析啟動子區(qū)域的順式作用元件，用 UGENE軟件從基因組序列中獲取起始密碼子上游1 500 bp基因序列，plantCARE軟件（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）搜索順式作用原件，確定啟動子區(qū)域包含順勢作用元件。

1.5 番茄CBL、CIPK基因家族相互作用分析

以STRING軟件（http://string-db.org/）分析番茄13個SlCBLs和22個SlCIPKs相互作用[18]，保留可信度大于0.700相互作用關(guān)系，隱藏?zé)o相互作用蛋白。

1.6 番茄低溫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中番茄CIPK表達量分析

以Reads Per Kilobase per Million mapped reads（RPKM）分析基因表達水平。計算番茄低溫（4℃）脅迫下CIPK基因家族表達量，Heml繪制熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄CIPK基因家族的鑒定及生物信息學(xué)分析

經(jīng)生物信息學(xué)分析，鑒定番茄中22個SlCIPK基因家族成員，除10號染色體外均有分布，其中五號染色體上分布成員最多。番茄CIPK基因家族成員氨基酸長度差異較小，變化范圍為419 aa（SlCIPK14）～478 aa（SlCIPK11、SlCIPK3）。番茄CIPK成員等電點變化范圍為6.21（SlCIPK22）～9.21（SlCIPK5）。在番茄CIPK基因家族中分子質(zhì)量最小成員為SlCIPK15（47.6 ku），最大為SlCIPK6（57.8 ku）（見表1）。

表1 番茄CIPK基因家族特征分析Table 1 Character of tomato CIPK genes

2.2 番茄CIPK基因系統(tǒng)進化分析

通過番茄、擬南芥、楊樹、小麥、水稻、加拿大油菜組成系統(tǒng)進化樹分析，CIPKs可分為A、B、C、D、E、F、G、H八個亞組，其中A亞組包 含 SlCIPK17、 SlCIPK14、 SlCIPK12， SlCIPK17與PtCIPK21為垂直同源基因?qū)?，SlCIPK14、SlCIPK12為平行同源基因?qū)?；B亞組中包含SlCIPK18和SlCIPK5，二者為平行同源基因?qū)Γ籆亞組中僅包含SlCIPK3；D亞組中包括SlCIPK16和SlCIPK13；E 亞組中 包 含 SlCIPK11、 SlCIPK9、SlCIPK4和SlCIPK6，SlCIPK4和SlCIPK6為平行同源基因?qū)?；F亞組包括SlCIPK15和SlCIPK21，二者為平行同源基因?qū)?；G亞組中的SlCIPK10和SlCIPK22也為平行同源基因?qū)?；H亞組中成員最多，番茄CIPK家族成員數(shù)量最多，包括：SlCIPK20、 SlCIPK7、 SlCIPK2、 SlCIPK8、 SlCIPK1和SlCIPK19，SlCIPK1和SlCIPK19為平行同源基因?qū)Γㄒ妶D1）。

圖1 CIPK家族進化樹分析Fig.1 Unrooted neighborjoining phylogenetic tree of CIPK genes

圖2 番茄CIPK基因外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Exon-intron structure of tomato CIPK genes

2.3 番茄CIPK基因結(jié)構(gòu)分析

由圖2可知，番茄CIPK基因家族分為內(nèi)含子富集和內(nèi)含子缺失兩類，其中SlCIPK9、SlCIPK11、SlCIPK15、SlCIPK21、SlCIPK13、SlCIPK16、SlCIPK3、SlCIPK17、SlCIPK5、SlCIPK18 無內(nèi)含子；SlCIPK4、SlCIPK6、SlCIPK12僅1個內(nèi)含子，以上成員均屬于內(nèi)含子缺失組；SlCIPK1、SlCIPK2、SlCIPK8含14個內(nèi)含子，SlCIPK7、SlCIPK20含13個內(nèi)含子，SlCIPK10、SlCIPK22含11個內(nèi)含子，以上成員均屬多內(nèi)含子富集組。

2.4 番茄CIPK基因家族順式作用原件分析

番茄CIPK基因家族成員上游1 500 bp存在多個與植物逆境應(yīng)答相關(guān)順式作用原件，其中77%（17/22）成員具有TC-richment順式作用原件，說明大多數(shù)成員均與防衛(wèi)和逆境應(yīng)答相關(guān)；68%（15/22）成員具有HSE作用原件，說明與響應(yīng)熱脅迫相關(guān)；36%（8/22）成員具有LTR順式作用原件，說明可能與冷脅迫應(yīng)答相關(guān)；36%（8/22）成員具有茉莉酸甲酯應(yīng)答元件；36%（8/22）成員具有BOX-W1原件說明這些基因在真菌侵染后可能發(fā)揮作用，且具BOX-W1原件的CIPK成員均有w-box原件；7個CIPK家族成員存在ABRE原件，說明32%成員可能與脫落酸應(yīng)答相關(guān)；7個CIPK家族成員存在MBS原件，說明32%成員與干旱脅迫相關(guān)；僅4個基因具有TCA原件，可能與水楊酸應(yīng)答相關(guān)（見表2）。

表2 番茄CIPK順式作用元件分析Table2 Cis-elementsanalysis of tomato CIPK genes

2.5 番茄CBL、CIPK基因家族相互作用分析

由圖3可知，SlCBLs與SlCIPKs間互作關(guān)系復(fù)雜，但并非所有SlCIPK和SlCBL成員參與，預(yù)測SlCIPK2、 SlCIPK14、 SlCIPK3、 SlCIPK15、SlCIPK18、 SlCIPK19、 SlCIPK11、 SlCIPK21、SlCIPK17、 SlCIPK8、 SlCIPK10、 SlCIPK12 參與CBL-CIPK互作。番茄某一CIPK蛋白可結(jié)合一個或多個CBL蛋白，同時某一CBL蛋白也可與一個或多個CIPK蛋白相互作用。

圖3 SlCBLs-SlCIPKs相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.3 SlCBLs-SlCIPKs interaction network

圖4 番茄CIPK基因表達分析Fig.4 Expression analyses of tomato CIPK genes

2.6 番茄低溫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中CIPK表達量分析

結(jié)果見圖4。

由圖 4可知，SlCIPK1、SlCIPK2、SlCIPK15、SlCIPK14、SlCIPK21、 SlCIPK3、 SlCIPK9、SlCIPK10、SlCIPK7、SlCIPK18、SlCIPK12、SlCIPK22 冷誘導(dǎo)12 h后表達量升高；SlCIPK13、SlCIPK20、SlCIPK11、SlCIPK7、SlCIPK19、SlCIPK4、SlCIPK4冷誘導(dǎo)后表達量幾乎無變化；在番茄中SlCIPK5、SlCIPK6、SlCIPK8、SlCIPK16表達量較低。

3 討論與結(jié)論

本研究利用生物信息學(xué)方法從番茄中鑒定22個SlCIPK基因。目前，已在多種植物中發(fā)現(xiàn)CIPK基因：劉淑梅等在加拿大油菜中鑒定出26個BnaCIPK26基因[18]；Hanfeng等在楊樹中發(fā)現(xiàn)27個PtCIPK基因[19]；Yanhua等在小麥中鑒定出32個TaCIPK基因[20]；Ting等在茄子中發(fā)現(xiàn)25個SmCIPK基因[21]。番茄除10號染色體外均有SlCIPK分布，氨基酸長度變化范圍419～478 aa，等電點變化范圍6.21～9.21，分子質(zhì)量變化范圍47.6～57.8 ku。由番茄、擬南芥、楊樹、小麥、大米及加拿大油菜CIPK成員構(gòu)建系統(tǒng)進化樹可分為A、B、C、D、E、F、G、H八個亞組且每個亞組中均有SlCIPK分布，其中 SlCIPK12 與 SlCIPK14、 SlCIPK18 與 SlCIPK5、SlCIPK4與SlCIPK6、SlCIPK15與SlCIPK21、SlCIPK10與SlCIPK22、SlCIPK1與SlCIPK19為平行同源基因?qū)Γ籗lCIPK17與PtCIPK21為垂直同源基因?qū)?。SlCIPKs分為內(nèi)含子富集組和內(nèi)含子缺失組，與木薯 MeCIPK基因中發(fā)現(xiàn)一致[22]。根據(jù)基因序列內(nèi)含子情況，擬南芥CIPK基因家族分為兩個分支，第一種不含內(nèi)含子或僅含有1個內(nèi)含子，第二種CIPK蛋白激酶含有9個或以上內(nèi)含子。不含內(nèi)含子或僅含1個內(nèi)含子CIPK基因系統(tǒng)發(fā)生于含9個或以上內(nèi)含子基因之后，可能是第二類含9個或以上內(nèi)含子基因mRNA反轉(zhuǎn)錄過程中，重新插入基因組而出現(xiàn)分支[23]。通過蛋白相互作用預(yù)測發(fā)現(xiàn)，1個SlCBL蛋白可與1個或者多個SlCIPK蛋白相互作用。同樣，1個SlCIPK蛋白也可與1個或多個SlCBL相互作用，與木薯和辣椒中發(fā)現(xiàn)一致[22,24]。通過冷脅迫下轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，番茄CIPK基因家族中多個成員受冷脅迫后表達量發(fā)生變化。擬南芥中AtCBL9-AtCIPK3和AtCBL1-AtCIPK7參與低溫誘導(dǎo)調(diào)控，其中AtCIPK3基因可能通過調(diào)控CBF/DREB1轉(zhuǎn)錄因子基因調(diào)節(jié)抗冷基因表達[10-11]。本研究通過一系列生物信息學(xué)分析，為深入研究番茄 CIPK基因家族功能奠定基礎(chǔ)，有待后續(xù)研究驗證番茄CIPK基因家族生物學(xué)功能。

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