耿新惠 張峰波 姜 敏 趙 慧 安夢婷 龐楠楠 王紅英 丁劍冰

(新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗科，烏魯木齊 830063)

包蟲病(Echinococcosis)，又稱棘球蚴病，是細(xì)粒棘球絳蟲的幼蟲感染人體所致的疾病。牧區(qū)較多見[1]，包蟲感染后，參與機(jī)體免疫反應(yīng)的因子有很多，以往我們研究過Th1細(xì)胞相關(guān)因子、Th2細(xì)胞相關(guān)因子、Th17細(xì)胞相關(guān)因子和Treg細(xì)胞，一般以Th1/Th2細(xì)胞的失衡來評價感染狀況[2-4]。目前認(rèn)為CD4+T細(xì)胞新亞群、濾泡輔助性T細(xì)胞 (Follicular helper T Tfh)可通過調(diào)節(jié)B細(xì)胞介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，輔助B細(xì)胞占主導(dǎo)地位的T細(xì)胞亞群[5,6]。據(jù)文獻(xiàn)報道，Tfh及其相關(guān)分子同樣參與寄生蟲感染后體液免疫應(yīng)答[7]。調(diào)節(jié)Tfh細(xì)胞的輔助因子有很多。白介素-21(Interleukin-21，IL-21)主要由Tfh細(xì)胞分泌，除了作為刺激B細(xì)胞的“輔助細(xì)胞因子”外,還是Tfh自分泌細(xì)胞因子。IL-21參與了自身免疫病和免疫缺陷的發(fā)病機(jī)制,并在絲蟲病、瘧疾及利什曼病的相關(guān)研究中也發(fā)現(xiàn)了一定作用。很可能成為治療這些疾病的重要靶分子。B細(xì)胞淋巴瘤分子6(B cell lymphoma 6，BCL-6)是調(diào)控初始 T 細(xì)胞發(fā)育為 Tfh 細(xì)胞所必需的，且是 Tfh 細(xì)胞分化的充分必要條件[8]，其表達(dá)增高有利于 Tfh 細(xì)胞相關(guān)分子的表達(dá)，B淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)成熟蛋白1(B lymphocyte-induced maturation protein-1，Blimp-1)是 B 淋巴細(xì)胞終極分化的主要調(diào)控子，是 Tfh 細(xì)胞的關(guān)鍵抑制因子，Blimp-1 的表達(dá)能阻止BCL-6 的表達(dá)和 Tfh 細(xì)胞的分化，并不會抑制Th1、Th2、Th17、Treg 等其他CD4+T 細(xì)胞的分化。這3種因子的表達(dá)變化在一定程度上反映了 Tfh細(xì)胞免疫應(yīng)答狀態(tài)[9,10]。BCL-6 通過與抑制性轉(zhuǎn)錄因子Blimp-1 的相互作用改變初始 CD4+T 細(xì)胞在Tfh細(xì)胞與Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞、Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞間的轉(zhuǎn)換，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫平衡，參與多種感染性疾病的發(fā)生。但是這3種因子在包蟲病感染中的作用目前尚不清楚。因此，本次研究采用ELISA和RT-PCR法對CE患者血漿中IL-21水平及外周血單個核細(xì)胞(PBMC)中IL-21 mRNA、BCL-6 mRNA、Blimp-1 mRNA進(jìn)行檢測，探討這幾種因子在CE病程中的變化特點，為CE的病因分析和臨床治療提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象 收集2016年6～12月新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院確診的CE患者27例，全部為肝臟感染病例，處于活動期，年齡在20～55歲之間，排除具有自身免疫性疾病患者。以30名健康體檢者作為對照組。對照組要求無肝病，無自身免疫性疾病，近期無感染。影像學(xué)未檢出包蟲特殊影像。手術(shù)治療組，追蹤17例行手術(shù)摘除包囊患者，術(shù)后3個月復(fù)查影像學(xué)和血清學(xué)，均為陰性者收納為治療后組。所有受試者要求早晨空腹抽取外周靜脈血約9 ml，一部分以EDTA抗凝，無溶血。一部分無抗凝，用于分離血清。

1.1.2試劑與儀器 ELISA試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)有限公司；RT-PCR 試劑盒購自德國Qiagen公司；Trizol 試劑購自美國Invitrogen公司；目的基因及內(nèi)參引物均由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 肝包蟲病患者入院后于次日清晨空腹抽取EDTA抗凝血約5 ml，用于分離外周血單個核細(xì)胞(PBMC)并從中提取總RNA 。同時抽取4 ml未抗凝血，離心取血清，于-70℃保存用于檢測IL-21。

1.2.2ELISA法檢測血清中IL-21濃度 取出冷凍血清，復(fù)溶至室溫。嚴(yán)格按照試劑盒操作步驟進(jìn)行。酶標(biāo)儀波長設(shè)置為450 nm，讀吸光度(OD)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算 IL-21 的濃度值。

1.2.3實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測CE患者及健康對照外周單個核細(xì)胞中Blimp-1/BCL-6/IL-21 mRNA 表達(dá)情況 按照試劑盒說明提取總RNA后用核酸蛋白分析儀測定其純度，確定是否達(dá)到反轉(zhuǎn)錄要求，將合格標(biāo)本逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。實時熒光定量PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃ 10 min，95℃ 15 s，59℃ 1 min ，40 個循環(huán)。計算 CE 組和健康組患者三種 mRNA 表達(dá)量，重復(fù)3 次取平均值。結(jié)果分析 ：采用2-ΔΔCT相對定量法，測定特定熒光域值對應(yīng)循環(huán)數(shù)的CT值 ，對目標(biāo)基因進(jìn)行定量分析。

引物設(shè)計和合成:從 Gene Bank中檢索人IL-21、BCL-6、Blimp-1 mRNA 基因引物序列，用 DNAMAN 軟件設(shè)計引物 ，引物由上海生工生物公司合成，見表1。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理，分析采用成組t檢驗，結(jié)果以P值表示，指標(biāo)間相關(guān)性用Pearson相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1qRT-PCR法檢測 Blimp-1、IL-21和BCL-6mRNA表達(dá)量

表1引物列表

Tab.1Listofprimers

PrimersSequence(5′to3′)IL?21＿FACACAGACTAACATGCCCTTCAIL?21＿RACCGTGAGTAACTAAGAAGCAAATCBCL?6＿FGGAAACCCAGTCAGAGTATTCGBCL?6＿RCACATTTGTAGGGCTTTTCTCCBlimp?1＿FTCCAGCACTGTGAGGTTTCABlimp?1＿RTCAAACTCAGCCTCTGTCCA

2.1.1CE組和健康對照組的mRNA表達(dá)水平 利用qRT-PCR檢測PBMC中相關(guān)因子表達(dá)，結(jié)果顯示，CE組BCL-6 mRNA表達(dá)水平升高，是對照組的39.8倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。IL-21 mRNA表達(dá)水平升高，是對照組的10.1倍,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。 但是 Blimp-1 mRNA在人感染棘球蚴后體內(nèi)表達(dá)水平變化不明顯(P>0.05)，無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

2.1.2三種因子在CE患者治療前和治療后的mRNA表達(dá)水平 在CE患者中我們將最終跟蹤到的17個治愈病例與治療前患者Blimp-1/BCL-6/IL-21 mRNA結(jié)果相比較，三種因子的mRNA表達(dá)水平在手術(shù)治療后均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表3。

2.2不同分組外周血IL-21水平的比較

2.2.1CE病例組和健康對照組中IL-21水平 利用 ELISA法檢測CE組和健康組外周血清標(biāo)本中IL-21水平，結(jié)果顯示病例組IL-21表達(dá)量為(313.0±62.4)ng/L,而健康對照組表達(dá)量僅為(179.4±32.1)ng/L,兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖1。

2.2.2CE患者治療前后外周血IL-21水平 利用 ELISA法檢測CE組治療前后外周血清標(biāo)本中IL-21水平，結(jié)果顯示治療前IL-21表達(dá)量為(352.6±37.7)ng/L,而健康對照組表達(dá)量僅為(176.4±27.7)ng/L,兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。

表2兩組IL-21BCL-6、BLIMP-1mRNA表達(dá)定量結(jié)果

Tab.2TwogroupsofIL-21/BCL-6/Blimp-1mRNAexpressionofquantitativeresults

GroupsnIL?21BCL?6Blimp?1Patients300 45±0 150 059±0 0960 05±0 02Healthy274 56±0 892 35±0 50 05±0 03t-25 23-24 99-0 126P<0 01<0 010 9

表3CE患者治療前后兩組IL-21、BCL-6、Blimp-1mRNA表達(dá)水平定量結(jié)果

Tab.3BeforeandaftertreatmentinCEpatientswithtwogroupsofIL-21/BCL-6/Blimp-1mRNAexpressionlevelofquantitativeresults

GroupsnIL?21BCL?6Blimp?1Beforetreatment174 58±0 82 48±0 570 048±0 028Aftertreatment170 96±0 360 61±0 380 039±0 023t13 59111 0823 194P<0 01<0 010 01

2.3相關(guān)性分析 將CE患者IL-21和Blimp-1、BCL-6 mRNA結(jié)果分別做Pearson直線相關(guān)性分析，如圖3A～C顯示IL-21與BCL-6的表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.01)，IL-21與Blimp-1不相關(guān)(P=0.179)，并且BCL-6和Blimp-1的表達(dá)也不相關(guān)(P=0.157)，分析結(jié)果見圖3。

圖1 CE病例組和健康對照組中IL-21水平比較Fig.1 CE cases and healthy controls level of IL-21

圖2 CE患者治療前后IL-21水平比較Fig.2 CE IL-21 levels before and after treatment

圖3 三種因子的相關(guān)性分析Fig.3 Correlation analysis of three factorsNote:A.IL-21 and BCL-6；B.IL-21 and Blimp-1；C.Blimp-1 and BCL-6.

3 討論

肝包蟲病是由細(xì)粒棘球絳蟲的蚴蟲侵入肝臟所致,在中國主要流行于畜牧業(yè)發(fā)達(dá)的新疆、青海、寧夏、甘肅、內(nèi)蒙古和西藏等省區(qū)是牧區(qū)常見病。包蟲囊腫在肝內(nèi)逐漸長大，可發(fā)生感染、破裂播散及空腔臟器阻塞等并發(fā)癥，嚴(yán)重影響當(dāng)?shù)氐纳a(chǎn)和生活。人感染細(xì)粒棘球蚴后，體內(nèi)原有免疫系統(tǒng)平衡被打破，在與包蟲對抗的過程中逐漸建立起新的平衡，因此免疫系統(tǒng)在對抗包蟲病的發(fā)生和發(fā)展中起著非常重要的作用[11]。前期研究發(fā)現(xiàn)慢性細(xì)粒棘球蚴感染過程中發(fā)生了Th1/Th2免疫失衡現(xiàn)象,以往認(rèn)為,Th2細(xì)胞通過分泌IL-4刺激B細(xì)胞增殖和Ig類別轉(zhuǎn)換[12],上調(diào)B細(xì)胞CD40和MHCⅡ類分子的表達(dá),是輔助B細(xì)胞的主要T細(xì)胞[13]?，F(xiàn)在越來越多的研究傾向于Tfh是輔助B細(xì)胞的主要T細(xì)胞亞群[14],而Th1和Th2所分泌的細(xì)胞因子在B細(xì)胞活化和Ig類別轉(zhuǎn)換中只起到調(diào)節(jié)作用[15]。參與肝包蟲免疫病理的因子大多數(shù)為CD4+T 細(xì)胞、也有CD8+T 細(xì)胞、B細(xì)胞、漿細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞[16,17]，其中CD4+T細(xì)胞主要為Tfh細(xì)胞，而Tfh細(xì)胞是T細(xì)胞分化和生存的重要信號[18]。IL-21是Tfh細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子。能促進(jìn)Tfh細(xì)胞的分化，調(diào)節(jié)B細(xì)胞和漿細(xì)胞分化，刺激免疫球蛋白的產(chǎn)生和類型轉(zhuǎn)換，誘導(dǎo)BCL-6和Blimp-1的表達(dá)[19]。IL-21具有促炎作用，通過調(diào)節(jié)體液免疫參與肝包蟲病的病程進(jìn)展。在本次的研究中可以觀察到CE患者感染棘球蚴的中晚期，在外周循環(huán)血中表達(dá)上調(diào)到基礎(chǔ)水平的2倍左右，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。并在有效治療后，下降到較低的水平，此水平與健康對照組基礎(chǔ)水平基本一致。另外，我們做了IL-21和BCL-6及Blimp-1的相關(guān)性研究，在研究中發(fā)現(xiàn)IL-21與BCL-6呈正相關(guān)性。這與其他感染性疾病患者同樣，BCL-6對Tfh細(xì)胞的表達(dá)有上調(diào)作用，而IL-21又是Tfh細(xì)胞的主要效應(yīng)分子，由此我們可以推斷出BCL-6、Tfh、IL-21是CE患者免疫反應(yīng)中反饋調(diào)節(jié)的軸心[20]。同時，我們在IL-21與Blimp-1相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)，他們之間無必然聯(lián)系。Blimp-1能促進(jìn)B細(xì)胞向漿細(xì)胞轉(zhuǎn)換從而調(diào)節(jié)抗體的釋放。據(jù)報道[21]，與其在B細(xì)胞中的功能不同,Blimp1可能并不是T細(xì)胞發(fā)揮抗寄生蟲免疫的關(guān)鍵蛋白。Blimp1基因的表達(dá)常與T細(xì)胞反應(yīng)不同步,即在T細(xì)胞受到抗原刺激后幾天才能達(dá)到峰值[22]。我們在此次結(jié)果中觀察到Tfh細(xì)胞的關(guān)鍵因子IL-21和Blimp-1產(chǎn)生量不一致的現(xiàn)象，有待于進(jìn)一步研究。

BCL-6是Tfh 細(xì)胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控初始T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Tfh細(xì)胞，進(jìn)一步促進(jìn)Tfh細(xì)胞表達(dá)趨化因子CXCR5，共刺分子ICOS[23]，進(jìn)而與 B細(xì)胞相互作用，BCL-6高表達(dá)能促進(jìn)Tfh細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)并且抑制Th1、Th17細(xì)胞的分化。據(jù)報道，人感染蠕蟲后，淋巴器官表達(dá)標(biāo)記為CXCR5和ICOS 的CD4+濾泡輔助性T細(xì)胞，感染后的Tfh 細(xì)胞表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子BCL-6，分泌細(xì)胞因子IL-21，還表達(dá)GATA3，這是Th2分化的轉(zhuǎn)錄因子[24]。在本研究中發(fā)現(xiàn)CE患者體內(nèi)高表達(dá)BCL-6，說明與其他寄生蟲感染一樣，BCL-6的轉(zhuǎn)錄控制了T細(xì)胞的分化與分泌，與包蟲感染過程密不可分。

研究發(fā)現(xiàn)，CD4+T細(xì)胞中的非Tfh細(xì)胞的細(xì)胞核中高表達(dá)Blimp-1[25]，與Tfh細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子BCL-6具有相互拮抗作用[26]，同時B細(xì)胞中Blimp-1作為BCL-6的拮抗劑可抑制Tfh細(xì)胞分化，反之，BCL-6也抑制 Blimp-1表達(dá)，促進(jìn)Tfh細(xì)胞分化。Tfh細(xì)胞數(shù)量和功能的異常使自身免疫失衡[27]，在本研究中發(fā)現(xiàn)BCL-6和Blimp-1在疾病的發(fā)展中同時都升高，但不成正相關(guān)性，就本病來說，CE患者臨床分型也較多，此次試驗未做臨床分型評價，或許兩者之間在更細(xì)的范圍內(nèi)有很好的相關(guān)性，這在以后的實驗當(dāng)中可以進(jìn)一步研究。

綜上所述，我們探討了CE病患者血清中IL-21、外周單個核細(xì)胞中IL-21、Blimp-1和BCL-6的mRNA表達(dá)水平，并在研究中發(fā)現(xiàn)，Tfh細(xì)胞亞群的相關(guān)因子BCL-6、Blimp-1、IL-21在CE病程中均升高，并隨治療后明顯下降，這表明三種因子可能參與了細(xì)粒棘球蚴感染人體的免疫病程，尤其是BCL-6在T細(xì)胞分化及產(chǎn)生相關(guān)效應(yīng)因子IL-21的過程中起到主要調(diào)節(jié)作用。本研究還明確了Tfh及其相關(guān)因子參與肝包蟲的發(fā)病機(jī)制。為研究包蟲病治病機(jī)制拓寬了思路。

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