許朝卿 戴遲兵 汪應(yīng)瑞

(三峽大學(xué)附屬仁和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，宜昌 443001)

多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis，MS)是一種累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎性脫髓鞘病。以往的研究證實，MS可能是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用所引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病，其發(fā)病機制不完全清楚[1]。有研究表明，炎癥在神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘病變的形成和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[2]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，細胞因子在神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘病變中占有重要地位，炎癥因子的水平與MS患者的疾病嚴重程度有關(guān)[3]，白介素-32(Interleukin-3,IL-32)作為一種內(nèi)源性的炎癥調(diào)控因子，在炎癥中起著關(guān)鍵作用[4]。最近研究發(fā)現(xiàn)，IL-32基因多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡、急性肺損傷及癌癥等多種炎癥性疾病密切相關(guān)[5-7]。因此，本研究探討 IL-32基因多態(tài)性與MS遺傳易感性的關(guān)系，擬尋找一種新的炎癥因子為臨床MS的治療提供潛在的靶點，同時，為MS高危人群的篩查提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象 選取2012年～2016年于我院就診的MS患者 580 例,所有病例的診斷均符合2005年McDonald的MS診斷標準及1999年Wingerchuck NMO的診斷標準[8]。所有入選患者均為新確診的患者,其中男性 360 例,女性220 例,年齡(32.7±10.26)歲。 同時，選取650例同期同地區(qū)健康無血緣關(guān)系的個體作為對照,其中男性400 例,女性 250例,年齡(33.2±9.18)歲。所有入選對象排除心血管疾病、高血壓、糖尿病、腎功能不全、感染性疾病、免疫性疾病及其他惡性腫瘤性疾病。本次研究經(jīng)過我院倫理委員會批準。

1.1.2主要試劑和儀器 PCR產(chǎn)物(德國Qiagen公司)，蝦堿酶和外切酶Ⅰ分別購自美國Promega公司和Epieentre公司，SNaPshot Multiplex試劑盒購自美國ABI公司，IL-32試劑盒(上海江萊生物科技有限公司) 。

1.2方法

1.2.1DNA 的提取和基因型檢測 采集靜脈血2 ml 于EDTA 抗凝管-20℃保存。DNA的提取采用改良碘化鈉法，經(jīng)純度鑒定后-20℃保存?zhèn)溆?。上海天昊生物科技有限公司根?jù)IL-32基因rs28372698，rs12934561及rs11861531位點多態(tài)性和已知的DNA序列設(shè)計PCR引物。rs28372698位點的上下游引物序列分別為:5′-CCATGGGTGTGGAGGTTCATAAAG-3′，5′-GAATGGAAGGTCTTGAT-GGGAGAG-3′。 rs12934561位點的上下游引物序列分別為5′-AGGCCCGAATGGTAAGCT-3′，5′-CCACAGTGTCCTCAGTGTCAC-3′。 rs11861531位點的上下游引物序列分別為5′-ATGAGTATGCCTGC-CGTGTG-3′，5′-AATGCGGCATCTTCAAAC-3′。IL-32的PCR擴增反應(yīng)體系為 5 μl，其中包含2.5 μl緩沖液，0.25 μl反應(yīng)物，1.75 μl去離子水。若擴增反應(yīng)體系不足，則用滅菌雙蒸水補足至5 μl。擴增程序主要包括：95℃ 10 min變性，92℃ 15 s和60℃ 1 min 共69個循環(huán)。PCR產(chǎn)物 4℃保存。采用GeneMapper4.1分析SNP分型。

1.2.2血清IL-32水平的檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法測定IL-32血清水平，實驗操作嚴格按照說明書進行。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件包進行統(tǒng)計分析。等位基因和基因型分布頻率采用直接計數(shù)法計算，各分布頻率比較采用卡方檢驗。 IL-32血清水平的組間比較采用t檢驗,遺傳平衡檢驗采用Hardy-Weinberg，采用SHEsis分析軟件行連鎖不平衡分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1MS患者臨床特點 在所有入選的MS患者中，復(fù)發(fā)緩解型占77.9%(452/580),繼發(fā)進展型占20%(116/580)以及進展型占2.1%(12/580)。MS患者的年齡和性別與對照組比較，無顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表1)。

2.2MS患者組和健康對照組IL-32基因型頻率比較結(jié)果 檢測結(jié)果表明，rs28372698位點存在AA、AT、TT 3種基因型。rs12934561位點存在TT、CT、CC三種基因型。rs11861531位點存在CC、CT、TT 3種基因型。兩組三個位點的頻率均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(P>0.05)，表明該基因型在所研究人群中分布已達到了遺傳平衡?；驕y序進一步驗證了檢測結(jié)果。IL-32基因rs28372698 A/T位點的基因型頻率存在顯著差異(χ2=9.814，P=0.007)，其等位基因頻率在兩組間分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.561，P=0.033)。rs12934561C/T與 rs11861531 C/T的各基因型及等位基因頻率在兩組間差異無顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表2)。

表1MS患者和健康對照基線資料的比較

Tab.1ComparisonofbasicinformationbetweenMSpatientsandhealthycontrols

ItemMSpatients(n=580)Controls(n=650)StatisticsPGenderMale360(62 1%)400(61 5%)0 0370 848Female220(37 9%)250(38 5%)Age(year)32 7±10 2633 2±9 180 0420 967ClinicaltypesRelapsing?remitting452(77 9%)-Seconday?progressive116(20%)-Progressivity12(2 1%)-

2.3配對連鎖分析及單倍基因型分析結(jié)果 采用SHEsis在線分析軟件對rs28372698 A/T、rs12934561 C/T以及 rs11861531 C/T三個位點進行兩兩配對連鎖不平衡分析，結(jié)果顯示：三位點兩兩之間均存在連鎖不平衡(rs28372698 vs rs12934561,D′=0.874；rs28372698 vs rs11861531，D′=0.795；rs12934561 vs rs11861531，D′=0.931)。進一步的單倍型分析結(jié)果顯示，T-T-T單倍型在MS中的分布頻率顯著高于對照組(P=0.012)，T-T-T單倍型與MS的發(fā)病風(fēng)險密切相關(guān)(OR=1.968,95%CI:1.352-2.574，表3)。

表2IL-32基因rs28372698A/T、rs12934561C/T及rs11861531C/T基因型在兩組間的分布頻率

Tab.2GenotypefrequencydistributionofIL-32genesrs28372698A/T,andrs11861531rs12934561C/TC/TbetweenMSpatientsandcontrols

SNPgenotypingMSpatients(n=580)Controls(n=650)StatisticsPrs28372698A/TGenotypeAA240(41 4%)285(49 1%)9 8140 0071)AT255(44 0%)307(47 2%)TT85(14 7%)58(8 9%)AlleleA735(63 4%)877(67 5&)4 5610 0332)T425(36 6%)423(32 5%)rs12934561C/TGenotypeCC138(23 8%)141(21 7%)1 6430 440CT312(53 8%)345(53 1%)TT130(22 4%)164(25 2%)AlleleC588(50 7%)627(48 2%)1 4830 223T572(49 3%)673(51 8%)rs11861531C/TGenotypeCC192(33 1%)214(32 9%)0 1220 941CT302(52 1%)335(51 5%)TT86(14 8%)101(15 5%)AlleleC686(59 1%)783(60 2%)0 0080 927T474(40 9%)537(41 3%)

Note：1)Gnotype frequency was statistically differences in AA,AT and TT;2)Allele was statistically difference between A and T.

2.4IL-32血清水平在兩組的比較結(jié)果 MS患者組血清IL-32水平明顯高于對照組[(399.08±156.85)pg/ml vs (239.99±88.35)pg/ml，P=0.001]。進一步，在所有MS患者中，按照rs28372698 A/T位點的AA、AT、TT基因型分為三組，AT和TT基因型的MS患者IL-32血清水平明顯高于AA基因型MS患者，差異存在顯著統(tǒng)計學(xué)意義[(465.53±172.40)pg/ml vs (295.86±103.96)pg/ml,P<0.001;(491.15±133.65)pg/ml vs (295.86±103.96)pg/ml,P<0.001]。而AT型與TT型間的IL-32血清水平無顯著統(tǒng)計學(xué)差異[(465.53±172.40)pg/ml vs (491.15±133.65)pg/ml,P=0.612]。

3 討論

隨著人類基因掃描計劃的推進，完成了人類基因組DNA序列測序和分析工作，基因多態(tài)性在疾病中的影響逐漸受到重視。有研究表明，抗炎和促炎因素的失衡在MS患者的發(fā)病中扮演了重要的角色[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-32基因位點rs28372698與MS相關(guān)。IL-32基因rs28372698的三種基因型(AA、AT及TT)與等位基因(A、T)的分布頻率在MS患者和健康人群中存在比較較大的差異，MS患者的T等位基因攜帶明顯高于對照組，攜帶T等位基因的MS患者血清IL-32的表達水平明顯高于非攜帶者，提示rs28372698基因的變異促進IL-32的高表達。

表3IL-32單倍基因型在MS患者與對照組之間的分布情況及風(fēng)險分析

Tab.3RiskanalysisandhaploidgenotypedistributionbetweenMSpatientsandcontrols

IL?32haplotypeMSpatients(n=1160)Controls(n=1300)OR(95%CI)PA?C?C540(46 6)598(46 0)0 952(0 763-1 327)0 863A?T?T40(3 4)53(4 1)0 869(0 557-1 372)0 652A?C?T12(1 0)15(1 2)0 832(0 451-1 672)0 556T?C?C435(37 5)503(38 7)0 613(0 238-1 021)0 358T?T?T38(3 3)14(1 1)1 968(1 352-2 574)0 012A?T?C95(8 2)117(9 0)1 966(0 853-3 782)0 184

研究發(fā)現(xiàn)IL-32基因位點rs28372698與MS相關(guān)。有報道表明，IL-32的高表達與一些炎癥性疾病和感染性疾病相關(guān)[10，11]，進一步研究發(fā)現(xiàn)，IL-32牽涉到一些癌癥相關(guān)疾病的發(fā)病機制[12]。以往的研究證實，IL-32可以促進一些炎癥因子的高表達，如TNF-α、IL-6及IL-8，同時，IL-32也涉及到各種趨化因子的分泌和合成[13，14]。最近的研究表明，IL-32 rs28372698A/T，rs129345-61C/T及rs11861531 C/T三個位點的基因多態(tài)性與子宮內(nèi)膜癌、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及肺纖維化存在密切關(guān)系,這些研究證實了炎癥機制可能與IL-32的基因位點突變存在聯(lián)系[15-17]。炎癥在神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘病變的形成和發(fā)展是一個重要的因素。有研究證實，在MS患者外周血和腦脊液中，T淋巴細胞腫瘤壞死因子的 mRNA表達明顯增加，表達水平與疾病嚴重程度相關(guān)，同時，IL-6在MS患者血清中顯著升高，顯然，這些炎癥的調(diào)控過程與MS的發(fā)病密切相關(guān)[18-20]。重要的是，氧化應(yīng)激參與了MS的病理生理過程[21,22]，這個過程通過影響機體活性氧-炎癥平衡損傷神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘[23-25]。因此，IL-32可能作為一種炎癥調(diào)控因子參與了MS患者 IL-32基因位點rs28372698的基因變異過程。

MS的確切病因與發(fā)病機制至今不明，炎癥因素在許多發(fā)病環(huán)節(jié)中起著重要作用。本研究首次單堿基延伸和DNA測序?qū)L-32基因位點進行基因分型，證實了IL-32基因和MS易感等位基因的關(guān)系。在此基礎(chǔ)上進一步研究了IL-32相關(guān)的單倍型與MS的關(guān)系，這個發(fā)現(xiàn)將有助于闡明MS患者獨特的免疫和炎癥遺傳學(xué)機制，我們的研究結(jié)果可能為MS的分子分型、風(fēng)險預(yù)測、輔助診斷和治療方案提供重要的參考依據(jù)。

[1] Patejdl R,Penner IK,Noack TK,etal.Multiple sclerosis and fatigue:A review on the contribution of inflammation and immune-mediated neurodegeneration[J].Autoimmun Rev,2016,15(3):210-220.

[2] Keswani A,Kern RC,Schleimer RP,etal.Role of interleukin-32 in chronic rhinosinusitis[J].Curr Opin Allergy Clin Immunol,2013,13(1):13-18.

[3] Graber JJ,Ford D,Zhan M,etal.Cytokine changes during interferon-beta therapy in multiple sclerosis:correlations with interferon dose and MRI response[J].J Neuroimmunol,2007,185(1/2):168-174.

[4] 李 莉,寶福凱.白介素-32及其與炎癥性疾病的關(guān)系研究進展[J].中國熱帶醫(yī)學(xué),2010,10(6):761-762,770.

Li L，Bao FK.Advance in the research of relationship between IL-32 and inflammatory diseases[J].Chin Trop Med,2010,10(6):761-762.

[5] Gonzalez-Hormazabal P,Musleh M,Bustamante M,etal.Role of cytokine gene polymorphisms in gastric cancer risk in Chile[J].Anticancer Res,2014,34(7):3523-3530.

[6] Arcaroli JJ,Liu N,Yi N,etal.Association between IL-32 genotypes and outcome in infection-associated acute lung injury[J].Crit Care,2011,15(3):R138.

[7] Wang Y,Yang Y,Zhu Y,etal.Polymorphisms and expression of IL-32:impact on genetic susceptibility and clinical outcome of lung cancer[J].Biomarkers,2017,22(2):165-170.

[8] 中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)病學(xué)分會.中國多發(fā)性硬化及相關(guān)CNS脫髓鞘疾病的診斷和治療專家共識(草案)[J].中華神經(jīng)科雜志,2006,39(12):862-864.

Inese medical association neurology branch.The diagosis and treatment of China′s multiple sclerosis and related demyelinating centerl nerovus system disease(Draft)[J].Chin J Neurol,2006,39(12):862-864.

[9] Macchi B,Marino-Merlo F,Nocentini U,etal.Role of inflammation and apoptosis in multiple sclerosis:Comparative analysis between the periphery and the central nervous system[J].J Neuroimmunol,2015,287(287):80-87.

[10] Khawar MB,Abbasi MH,Sheikh N.IL-32:A novel pluripotent inflammatory interleukin,towards gastric inflammation,gastric cancer,and chronic rhino sinusitis[J].Mediators Inflamm,2016,2016:8413768.

[11] Kim S.Interleukin-32 in inflammatory autoimmune diseases[J].Immune Netw,2014,14(3):123-127.

[12] Wang J,Wang Q,Han T,etal.Soluble interleukin-6 receptor is elevated during influenza A virus infection and mediates the IL-6 and IL-32 inflammatory cytokine burst[J].Cell Mol Immunol,2015,12(5):633-644.

[13] Netea MG,Lewis EC,Azam T,etal.Interleukin-32 induces the differentiation of monocytes into macrophage-like cells[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2008,105(9):3515-3520.

[14] Saetta M,Baraldo S,Corbino L,etal.CD8+ve cells in the lungs of smokers with chronic obstructive pulmonary disease[J].Am J Respir Crit Care Med,1999,160(2):711-717.

[15] Yu XZ,Zhou B,Zhang Z,etal.Significant association between IL-32 gene polymorphisms and susceptibility to endometrial cancer in Chinese Han women[J].Tumour Biol,2015,36(7):5265-5272.

[16] Meyer B,Chavez RA,Munro JE,etal.DNA methylation at IL32 in juvenile idiopathic arthritis[J].Sci Rep,2015,5(5):11063.

[17] Li D,Chen D,Zhang X,etal.c-Jun n-terminal kinase and Akt signalling pathways regulating tumour necrosis factor-α-induced interleukin-32 expression in human lung fibroblasts:implications in airway inflammation[J].Immunology,2015,144(2):282-290.

[18] Mansouri B,Horner ME,Menter A.Tumor necrosis factor-α inhibitor use in psoriasis patients with a first-degree relative with multiple sclerosis[J].J Drugs Dermatol,2015,14(8):876-878.

[19] Yan J,Liu J,Lin CY,etal.Interleukin-6 gene promoter-572 C allele May play a role in rate of disease progression in multiple sclerosis[J].Int J Mol Sci,2012,13(10):13667-13679.

[20] Horellou P,Wang M,Keo V,etal.Increased interleukin-6 correlates with myelin oligodendrocyte glycoprotein antibodies in pediatric monophasic demyelinating diseases and multiple sclerosis[J].J Neuroimmunol,2015,289(15):1-7.

[21] Smith KJ,Lassmann H.The role of nitric oxide in multiple sclerosis[J].Lancet Neurol,2002,1(4):232-241.

[22] Koch M,Ramsaransing GS,Arutjunyan AV,etal.Oxidative stress in serum and peripheral blood leukocytes in patients with different disease courses of multiple sclerosis[J].J Neurol,2006,253(4):483-487.

[23] Gray E,Thomas TL,Betmouni S,etal.Elevated myeloperoxidase activity in white matter in multiple sclerosis[J].Neurosci Lett,2008,444(2):195-198.

[24] Zeis T,Probst A,Steck AJ,etal.Molecular changes in white matter adjacent to an active demyelinating lesion in early multiple sclerosis:molecular changes in MS periplaque white matter[J].Brain Pathol,2009,19(3):459-466.

[25] Fischer MT,Sharma R,Lim JL,etal.NADPH oxidase expression in active multiple sclerosis lesions in relation to oxidative tissue damage and mitochondrial injury[J].Brain,2012,135(Pt 3):886-899.