微流控技術(shù)在病原學(xué)檢測中的應(yīng)用綜述

宋波　王橋　張曉杰

【摘要】微流控芯片，又稱芯片實(shí)驗(yàn)室，是一種以在微米尺度空間對(duì)流體進(jìn)行操控為主要特征的技術(shù)平臺(tái)，微流控技術(shù)是一個(gè)由物理、化學(xué)、微加工技術(shù)與生物技術(shù)等學(xué)科組成的交叉領(lǐng)域，微型化、集成化的微流控芯片具有高效、快速、樣品和試劑用量少等優(yōu)點(diǎn)，促進(jìn)了其在病原體檢測中的應(yīng)用。對(duì)傳統(tǒng)方法以及微流控芯片在病原體檢測中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，并提出了微流控技術(shù)研究的優(yōu)勢。

【關(guān)鍵詞】微流控芯片 病原體 檢測微流控芯片，也被稱為微全分析系統(tǒng)，是將常規(guī)實(shí)驗(yàn)室中的加樣、反應(yīng)、分離檢測等基本操作在一塊幾平方厘米（甚至更?。┑男酒线M(jìn)行的方法，可以取代常規(guī)生物或化學(xué)實(shí)驗(yàn)室各種功能的一種高新技術(shù)平臺(tái)。本文將現(xiàn)有病原微生物檢測方法與微流控芯片方法進(jìn)行對(duì)比，針對(duì)該領(lǐng)域在病原微生物檢測方面的主要研究難點(diǎn)和發(fā)展趨勢進(jìn)行了討論。

一、現(xiàn)有的微生物檢測技術(shù)

病原微生物的檢測標(biāo)準(zhǔn)是培養(yǎng)法，此法簡單、直觀、費(fèi)用低，但該法耗時(shí)、操作繁瑣、靈敏性低，對(duì)操作人員要求高。免疫分選技術(shù)是利用抗原-抗體的特異性反應(yīng)，在檢測微生物中應(yīng)用非常廣泛，可定量檢測樣本中的微生物，但該法仍存在耗時(shí)、操作繁瑣、試劑耗量大的缺點(diǎn)，不能滿足臨床對(duì)感染性疾病快速診斷的需求。

聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）等分子生物學(xué)檢測法具有高度的特異性和靈敏度，檢測特異性基因片段從而達(dá)到多種病原菌的鑒定的目的，但本法存在過度敏感，假陽性率高，較復(fù)雜的樣本需要預(yù)處理等缺點(diǎn)，準(zhǔn)確性和特異性不高。

二、微流控芯片技術(shù)中常用的病原菌檢測分析技術(shù)

1.免疫分選技術(shù)

將免疫分選與微流控芯片技術(shù)結(jié)合是近年來的研究熱點(diǎn)，該法反應(yīng)體積在微升級(jí)，樣品和試劑耗量減少，提高了分選效率，芯片全程可控，簡化了操作流程，樣品擴(kuò)散距離縮短，節(jié)省了反應(yīng)時(shí)間，其高通量、高集成的特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)不同目標(biāo)菌的特異性分選和富集。

免疫分選技術(shù)主要包括三種方法：微通道免疫分選、免疫微珠分選和免疫磁珠分選。

微通道免疫分選是在微通道內(nèi)壁表面使用物理吸附或化學(xué)結(jié)合的方法固定抗體或其類似物，再向芯片內(nèi)加入待檢樣品，實(shí)現(xiàn)微生物的特異性捕獲檢測。Boehm等設(shè)計(jì)并制作了了微流控生物傳感器，在芯片上多個(gè)微室表面上修飾不同的特異性抗體，從而達(dá)到了同時(shí)檢測不同種類微生物的目的。該法的缺點(diǎn)是處理步驟較繁瑣，分選效率較低。

免疫微珠分選技術(shù)使用玻璃微珠進(jìn)行特異性抗體吸附，Varshney等設(shè)計(jì)微通道深度與微珠直徑尺寸相近，使得微珠在微通道中單層排列，將捕獲有大腸桿菌特異性抗體的免疫微珠填充于微通道中，利用化學(xué)發(fā)光法檢測微珠表面的大腸桿菌含量。由于微珠有更大的比表面積，因此能將更多的特異性抗體固定于一定表面上。但本法為了有效防止微珠在腔內(nèi)重疊造成光信號(hào)的阻滯，微珠必須呈單層排列，因此芯片的制備具有一定的難度。

免疫磁分選技術(shù)利用安裝于微通道附近的電磁場發(fā)生器俘獲磁珠，較微珠分選法更具自動(dòng)化和靈活性。Pivetal等設(shè)計(jì)一個(gè) S型微通道的芯片，在磁珠表面上修飾特異性抗體，對(duì)樣本中目標(biāo)微生物的檢測率達(dá)到了 98.46%。本法的缺點(diǎn)是，磁珠價(jià)格昂貴，實(shí)驗(yàn)需要產(chǎn)生磁場的裝置，因此本研究并不利于批量生產(chǎn)，限制了其發(fā)展成為臨床即時(shí)檢測設(shè)備。

2.基于核酸的熒光檢測

本法將PCR與微流控芯片結(jié)合，將自動(dòng)變溫的加熱器集成在微型反應(yīng)室上，實(shí)現(xiàn)樣品液在特定反應(yīng)室中變性、退火和延伸，通過對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物熒光標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)對(duì)待檢菌特異片段的實(shí)時(shí)定量分析。Lee通過這種方法完成登革熱病毒、腸道病毒71的分選和RNA病毒的檢測，檢測限可達(dá)到10-102PFU/m L。該方法雖然特異性和靈敏度很高，但對(duì)核酸蛋白質(zhì)的直接檢測鑒定更具有說服力。

三、展望

微流控芯片集成度高、準(zhǔn)確性好、試劑消耗低、反應(yīng)速度快，其要素涵蓋小型化實(shí)驗(yàn)的基本過程，如樣品分離、純化、試劑混合、探針雜交或合成以及樣品檢測等。隨著新技術(shù)的發(fā)展和信息化水平的提高，微加工技術(shù)的迅速發(fā)展，微流控芯片發(fā)展成為即時(shí)檢測和診斷儀器將成為極大的可能，在臨床病原體的早期診斷及藥敏試驗(yàn)等應(yīng)用中，具有極大的潛力。

此外，微流控芯片即時(shí)檢測儀器的檢測診斷對(duì)象由現(xiàn)有的血糖、肺結(jié)核、HIV、心臟標(biāo)志物等向外大幅延拓，有望覆蓋體育競技、海關(guān)口岸、應(yīng)急輔助醫(yī)療等諸多領(lǐng)域，這項(xiàng)技術(shù)未來將發(fā)展成為檢驗(yàn)科最重要的研究方法之一。

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