向玉婷,張俊玲,施志儀

(上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306)

Kisspeptin是一種重要的神經(jīng)內(nèi)分泌因子，通過(guò)調(diào)控促性腺激素釋放激素的分泌進(jìn)而控制哺乳動(dòng)物生殖軸的各種活動(dòng)[1-2]，在近幾年成為研究熱點(diǎn)。魚類Kisspeptin的研究始于2004年，Parhar等[3]在尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)中首次克隆了魚類第一個(gè)Kisspeptin的受體gpr54基因，發(fā)現(xiàn)性成熟羅非魚的gpr54基因可調(diào)控促性腺激素釋放激素的分泌進(jìn)而調(diào)控性腺的正常發(fā)育。目前，兩種形式的Kisspeptin基因，即kiss1和kiss2及其受體gpr54-1和gpr54-2，在多種魚類中已被鑒定[4-9]，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在某些魚類中如塞內(nèi)加爾鰨(Soleasenegalensis)、綠河豚(Tetraodonnigroviridis)和三刺魚(Gasterosteusaculeatus)等只有一種kiss2基因[5,7,10]。研究表明，kiss2基因?qū)ι彻δ艿恼{(diào)控作用要強(qiáng)于kiss1基因，斑馬魚(Daniorerio)kiss2基因是促性腺激素釋放激素分泌的主要調(diào)控因子[6,11-12]。

硬骨魚類Kisspeptin系統(tǒng)可以集成環(huán)境和代謝信號(hào)，并將這些信號(hào)傳遞到生殖軸[13]。Shahjahan等[14]研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚腦中kiss1及其受體系統(tǒng)只對(duì)低溫敏感，而kiss2及其受體系統(tǒng)則對(duì)高溫和低溫都極端敏感，表明兩種Kisspeptin系統(tǒng)在斑馬魚中有不同的調(diào)節(jié)機(jī)制。在星點(diǎn)東方鲀(Takifuguniphobles)產(chǎn)卵季節(jié)，溫度通過(guò)影響Kisspeptin及受體基因的表達(dá)進(jìn)而影響正常生理反應(yīng)[15]。除此之外，外源激素也可以影響魚類Kisspeptin系統(tǒng)的基因表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，在雄性尼羅羅非魚中外源甲狀腺激素可上調(diào)下丘腦kiss2基因的表達(dá)，且甲狀腺激素可能直接作用于促性腺激素釋放激素，而間接調(diào)控kiss2[16]。將稀有鮈鯽(Gobiocyprisrarus)暴露在17α-炔雌醇之下，可能會(huì)影響稀有鮈鯽kiss/gpr54/促性腺激素釋放激素系統(tǒng)的基因表達(dá)，從而干擾神經(jīng)內(nèi)分泌平衡[17]。

褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)屬鰈形目，是我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類，與其他大多數(shù)鰈形目魚類一樣，雌性褐牙鲆較雄性個(gè)體生長(zhǎng)快，其性別控制研究在魚類性別決定和性腺分化及生產(chǎn)中都具有重要意義[18-19]。魚類由于處于較低的分類地位，其性別分化具有很大的可塑性，許多環(huán)境因子如溫度、激素、pH、密度、光照等均可能影響其性別分化[20-21]，其中溫度和激素是最重要的影響因子[22]。本實(shí)驗(yàn)室先前已克隆和鑒定了褐牙鲆kiss2及其受體gpr54-2基因，并分析了其在褐牙鲆不同組織不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)二者在褐牙鲆腦和性腺中具有較豐富的表達(dá)，但關(guān)于其在褐牙鲆性腺分化中的作用及溫度、激素等對(duì)其表達(dá)的影響仍不清楚，因此本研究檢測(cè)了高溫和外源雌雄性激素誘導(dǎo)后，褐牙鲆早期性腺分化階段kiss2及其受體gpr54-2基因在腦和性腺中的表達(dá)變化情況，其結(jié)果為進(jìn)一步深入探討Kisspeptin系統(tǒng)在褐牙鲆性腺分化和生殖調(diào)控中的功能提供了新的資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)魚

試驗(yàn)用褐牙鲆胚胎和仔魚采集于中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院北戴河中心實(shí)驗(yàn)站，人工受精后在自動(dòng)過(guò)濾海水循環(huán)系統(tǒng)中自然孵化和飼養(yǎng)，控制海水鹽度33，溫度(16±1) ℃，孵化后仔魚用輪蟲和初孵鹵蟲無(wú)節(jié)幼體配合喂養(yǎng)。培育仔魚至25日齡后將其分為雄激素、雌激素、高溫和常溫對(duì)照4組分別飼養(yǎng)。采用的雌激素為17β-雌二醇，雄激素為17α-甲基睪酮，激素用無(wú)水乙醇溶解后質(zhì)量濃度為10 μg/L，采用直接浸浴法對(duì)褐牙鲆進(jìn)行雌性化和雄性化誘導(dǎo)；高溫組為28 ℃、常溫對(duì)照組保持在20 ℃，每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)重復(fù)。

各處理組分別在45、55、65日齡采集樣品，每個(gè)樣品采集15～20尾幼魚，解剖取腦和性腺部位組織，用焦碳酸二乙酯處理水清洗后立即浸入Trizol(Invitrogen)中勻漿，并在液氮中稍凍存后置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

將上述各樣品按照Trizol說(shuō)明書步驟提取總RNA，采用分光光度計(jì)(NANODROP2000C) 和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，所提取的總RNA其OD260/OD280值為1.8～2.0。用Dnase I(Promega)處理1 h，除去各樣品總RNA中的基因組DNA污染。

將處理后的總RNA作為模板，按以下體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：在無(wú)RNase的離心管中加入1 μg總RNA，1 μL OligodT Primer(50 μmol/L)，1 μL dNTP Mixture (10 mmol/L)，補(bǔ)充RNase free ddH2O至10 μL；然后在PCR儀上進(jìn)行變性退火反應(yīng)，條件為65 ℃ 5 min，冰上急冷5 min；加入以下試劑：5X PrimeScript Buffer 4 μL，RNase Inhibitor(40 U/μL)0.5 μL，Prime Script Rtase(200 U/μL)1 μL，補(bǔ)充RNase free ddH2O至20 μL；然后在PCR儀上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為42 ℃ 60 min，72 ℃ 15 min，然后冰上放置5 min，-20 ℃保存。

1.3 熒光定量PCR

根據(jù)已鑒定序列設(shè)計(jì)kiss2、gpr54-2及內(nèi)參基因18s的定量引物(表1)，在CFX96TouchTMReal Time PCR Detection System(Bio-Rad)上進(jìn)行定量檢測(cè)。

首先制備目的基因和內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)體系為20 μL，包括1 μL cDNA(從100～0.1 ng，5倍梯度稀釋)，0.4 μL特異性引物，10 μL 2×iQTMSYBR Green Supermix(Bio-rad)和8.2 μL ddH2O。反應(yīng)條件為：95 ℃ 1 min；95 ℃ 10 s和60 ℃ 15 s，采集熒光40次，然后進(jìn)行融解曲線的擴(kuò)增。標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果顯示目的基因和內(nèi)參基因的相關(guān)系數(shù)均>0.99，相應(yīng)的擴(kuò)增效率為95%～100%。其后對(duì)采集樣品進(jìn)行定量檢測(cè)，反應(yīng)體系和條件同上，試驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 熒光定量PCR引物

1.4 數(shù)據(jù)分析

目的基因相對(duì)表達(dá)量采用2-△△CT法計(jì)算，其數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，生物學(xué)重復(fù)(n)=3。統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS17.0軟件中的單因素方差分析，使用Dunnett’s T3 test 進(jìn)行差異性比較，當(dāng)P<0.05時(shí)表示有顯著差異，當(dāng)P<0.01時(shí)表示有極顯著差異。

2 結(jié) 果

2.1 高溫處理后kiss2和gpr54-2的表達(dá)變化

熒光定量PCR結(jié)果顯示：高溫處理后，kiss2在褐牙鲆腦中的表達(dá)明顯升高(P<0.01)；除在55日齡幼魚性腺中，其表達(dá)有一個(gè)顯著的下調(diào)外，kiss2在褐牙鲆性腺中的表達(dá)變化不明顯。相反，高溫處理后gpr54-2在褐牙鲆腦中的表達(dá)變化不顯著(55日齡除外)，而其褐牙鲆性腺中的表達(dá)變化較大，在45日齡和55日齡幼魚性腺中上調(diào)(P<0.01)，但在65日齡幼魚性腺中逐漸降低(P<0.05)(圖1)。

2.2 雌激素處理后kiss2和gpr54-2的表達(dá)變化

雌激素處理后，褐牙鲆腦中kiss2的表達(dá)升高(P<0.05)，而在性腺中其表達(dá)明顯下調(diào)；而gpr54-2則出現(xiàn)了不同的表達(dá)趨勢(shì)，其在45日齡幼魚腦中表達(dá)增加(P<0.01)，但在隨后的55日齡幼魚腦中又出現(xiàn)了明顯的下調(diào)；在性腺中，激素處理后gpr54-2基因在45日齡和55日齡表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，在65日齡逐漸降低(圖2)。

圖1 褐牙鲆腦和性腺中kiss2、gpr54-2在溫度處理后的表達(dá)變化

圖2 褐牙鲆腦和性腺中kiss2、gpr54-2在雌激素處理后的表達(dá)變化

2.3 雄激素處理后kiss2和gpr54-2的表達(dá)變化

雄激素處理后，褐牙鲆腦中kiss2的表達(dá)變化遲緩，至65日齡時(shí)才有較明顯的升高，但其受體基因gpr54-2在腦中的表達(dá)明顯降低(P<0.01)。同時(shí)，二者在褐牙鲆性腺中的表達(dá)明顯下調(diào)(圖3)。

圖3 褐牙鲆腦和性腺中kiss2、gpr54-2在雄激素處理后的表達(dá)變化

3 討 論

溫度是影響魚類性腺分化重要的環(huán)境因子之一，褐牙鲆的性腺發(fā)育、排卵及胚胎發(fā)育，均受溫度的影響[23,20]，而且高溫誘導(dǎo)還可使遺傳雌性褐牙鲆發(fā)生性逆轉(zhuǎn)，向生理雄性褐牙鲆轉(zhuǎn)變[21]。本研究結(jié)果表明，溫度對(duì)性腺分化早期褐牙鲆腦中kiss2和性腺中g(shù)pr54-2的基因表達(dá)有較大影響，高溫誘導(dǎo)可使其表達(dá)水平明顯上調(diào),但是在長(zhǎng)時(shí)間高溫處理下，kiss2基因?qū)囟茸兓幻舾?，?5日齡時(shí)與對(duì)照組基因表達(dá)無(wú)明顯差異，推測(cè)kiss2基因表達(dá)的變化可能只與環(huán)境溫度的改變有關(guān)。與此不同的是，研究表明在高溫條件下，斑馬魚腦中kiss2的基因表達(dá)水平會(huì)呈現(xiàn)明顯的減少趨勢(shì)，且伴隨著其受體基因gpr54-2的表達(dá)降低，而在低溫條件下，kiss1及其受體的基因表達(dá)會(huì)升高[14]；在星點(diǎn)東方鲀中，低溫(14 ℃)和高溫(28 ℃)處理都會(huì)使kiss2及其受體gpr54-2的基因表達(dá)降低，但在25 ℃處理3、7 d的研究中表明kiss2的表達(dá)略有升高[15]。這些研究表明，溫度會(huì)影響kiss2系統(tǒng)的基因表達(dá)，但不同溫度條件對(duì)不同種類的魚影響可能會(huì)不一樣，且其影響機(jī)制仍需要進(jìn)一步深入的研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，外源雌激素處理對(duì)性腺分化早期褐牙鲆腦中kiss2和性腺中g(shù)pr54-2的基因表有促進(jìn)作用，而對(duì)腦中g(shù)pr54-2和性腺中kiss2的表達(dá)卻有下調(diào)作用，表明二者在褐牙鲆不同組織部位對(duì)外源雌激素的刺激會(huì)產(chǎn)生不同的反應(yīng)。目前關(guān)于雌激素對(duì)魚類腦中kiss2和gpr54-2基因表達(dá)的影響有較多的報(bào)道，而其在性腺中的表達(dá)情況很少。在青鳉(Oryziaslatipes)中，17β-雌二醇處理對(duì)腦中kiss1的表達(dá)有一定的促進(jìn)作用[24]。在熱帶雀鯛(Chrysipteracyanea)中，用17β-雌二醇處理7 d后，其腦中g(shù)pr54-1和gpr4-2的基因表達(dá)量有顯著的升高[25]。在塞內(nèi)加爾鰨[26]和幼年斑馬魚[27]中，發(fā)現(xiàn)17β-雌二醇也可以上調(diào)腦中g(shù)pr54的表達(dá)；而用17α-乙炔雌二醇處理稀有鮈鯽，發(fā)現(xiàn)腦中kiss2的表達(dá)有升高，但性腺中g(shù)pr54-2的表達(dá)卻降低[17]。而且，Wang等[28]對(duì)金魚(Carassiusauratus)的研究中表明，雌激素可以通過(guò)不同的途徑調(diào)節(jié)兩類kiss基因的表達(dá)，其通過(guò)雌激素受體可直接作用于kiss2基因。因此，kiss-gpr54系統(tǒng)可能是雌激素作用的靶位置，進(jìn)而參與雌激素調(diào)節(jié)的魚類性腺發(fā)育。

雄激素處理后，褐牙鲆腦中kiss2基因在45日齡和55日齡變化不明顯，可能是其對(duì)雄激素處理反應(yīng)不敏感，但性腺中kiss2及其受體基因gpr54-2的表達(dá)受到了顯著的抑制作用，且gpr54-2在腦中的表達(dá)也明顯下調(diào)，總體上看雄激素處理對(duì)kiss2的效應(yīng)具有抑制作用。用17α-甲基睪酮誘導(dǎo)斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)，發(fā)現(xiàn)kiss2的表達(dá)在處理1周時(shí)有顯著的降低，但在4周后其表達(dá)反而會(huì)增加，這種改變可能是因?yàn)閗iss2對(duì)于17α-甲基睪酮產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)后進(jìn)而發(fā)生基因表達(dá)的改變[12]。綜上所述，Kisspeptin系統(tǒng)對(duì)外界環(huán)境因子如溫度、外源性激素等的變化反應(yīng)較敏感，但其如何將外界環(huán)境信號(hào)傳遞到生殖軸進(jìn)而參與調(diào)控魚類的性腺分化與繁殖等的內(nèi)在分子機(jī)制仍需要深入的探討。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明高溫和雌激素處理可以促進(jìn)褐牙鲆腦中kiss2和性腺中g(shù)pr54-2的表達(dá)，但下調(diào)了褐牙鲆性腺中kiss2的表達(dá)；而雄激素處理則使褐牙鲆腦和性腺中kiss2和gpr54-2的表達(dá)幾乎都受到顯著的抑制作用，為進(jìn)一步闡述kiss2和gpr54-2基因在褐牙鲆早期性腺分化中的作用奠定了基礎(chǔ)。

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