劉琨毅，王 琪*，馮雨辰，趙金松，袁華偉

（1.宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院 五糧液技術(shù)學(xué)院，四川 宜賓 644003；2.四川理工學(xué)院 生物工程學(xué)院，四川 自貢 643000；3.宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，四川 宜賓 644000）

黑豆?fàn)I養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、維生素、微量元素等多種營養(yǎng)成分，同時(shí)又具有多種生物活性物質(zhì)（如黑豆色素、黑豆多糖和異黃酮等）[1-3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，黑豆具有調(diào)節(jié)免疫、抗癌、抗氧化、降低膽固醇等功效[4-6]。由于其獨(dú)特的生物活性物質(zhì)，使其成為當(dāng)前食品領(lǐng)域研究和開發(fā)的熱點(diǎn)[7-9]。大米作為全球半數(shù)以上人口的主食，除了為機(jī)體提供生命必需的糖類、蛋白質(zhì)、脂肪等主要營養(yǎng)成分外，還為人體提供諸如鐵、錳、銅、鋅、硒等大量必需的微量元素[10-11]。

生料釀酒是微生物利用生淀粉直接進(jìn)行生長、繁殖及代謝的過程[12-13]，因其免去了傳統(tǒng)釀酒工藝中原料和輔料的蒸煮、上甑、攤晾等工序，進(jìn)而具有節(jié)約資源，提高酒率，操作簡便，便于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，被譽(yù)為我國白酒工業(yè)發(fā)展的方向[14-16]。目前，生料釀酒的原料來源廣泛，主要包括大米、玉米、高粱、小麥、紅薯等，但大多數(shù)生料酒廠使用單一的糧食釀酒，使其微生物代謝產(chǎn)物少，香氣單一，口感單薄不協(xié)調(diào)，為大規(guī)模推廣帶來困難[17-19]。姜莉莉[20]用黑豆和糯米混合發(fā)酵制成黑豆米酒，不僅增加了米酒的色香味，而且提高了米酒的營養(yǎng)價(jià)值和保健功效。本試驗(yàn)通過黑豆與大米混合用于生料釀酒，以期提高酒香，使酒體口感醇和協(xié)調(diào)，為工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1

.1 材料與試劑

生料曲：麗水力克生物科技有限公司；黑豆、大米：市售；乙酸、乙酸鈉（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BS210S型電子分析天平：北京賽多利斯天平有限公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；PHs-3c型精密pH計(jì)：上海理達(dá)儀器廠；800Y型多功能粉碎機(jī)：鉑歐五金廠；ZWYR-D2403型恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；Alcomat Super酒精度測試儀：意大利蓋博分析儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 黑豆米酒釀造工藝流程及操作要點(diǎn)

黑豆、大米→粉碎→加水→調(diào)整pH→接種→發(fā)酵→過濾→成品

操作要點(diǎn)：大米粉碎過40目篩，黑豆粉碎過60目篩，將兩種原料按不同的配比組合加入三角瓶中，并加入一定量的純凈水，調(diào)整溶液pH至4.0，接種后在30℃條件下靜置發(fā)酵，發(fā)酵前3天每天攪拌1次，待發(fā)酵結(jié)束后過濾得到黑豆米酒。

1.3.2 單因素試驗(yàn)方法

保持其他條件不變，分別考察物料比（黑豆∶大米）（1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1（g∶g）），料液比（1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3、1∶3.5（g∶mL）），接種量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%），發(fā)酵時(shí)間（15 d、17 d、19 d、21 d、23 d）對黑豆米酒感官評分的影響。

1.3.3 黑豆米酒發(fā)酵工藝條件的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken[21]的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以感官評分（Y）為考察指標(biāo)，進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，確定黑豆米酒最佳的發(fā)酵工藝條件，因素與水平如表1所示。

表1 黑豆米酒發(fā)酵工藝條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for black bean rice wine fermentation process optimization

1.3.4 測定方法

還原糖（以葡萄糖計(jì)）測定：斐林試劑法[22]；酒精度測定：酒精計(jì)法[22]；總酸的測定：電位滴定法[23]。固形物測定：按照參考文獻(xiàn)[24]的方法進(jìn)行。

感官評定由15名專業(yè)人員組成的感官評定小組參照NY/T 1885—2010《綠色食品米酒》[24]對黑豆米酒從色澤（滿分5分）、形態(tài)（滿分5分）、香氣（滿分30分）、滋味（滿分40分）、典型性（滿分20分）5個(gè)方面進(jìn)行評分，取15人的平均分，滿分為100分，感官評分標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。

表2 黑豆米酒感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of black bean rice wine

續(xù)表

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 物料比對黑豆米酒感官評分的影響

圖1 物料比對黑豆米酒感官評分的影響Fig.1 Effect of material ratio on sensory evaluation score of black bean rice wine

由圖1可知，隨著黑豆比例的逐漸增加，黑豆米酒的感官評分也隨之增加；當(dāng)黑豆與大米的比例達(dá)到1∶2時(shí)，黑豆米酒的感官評分達(dá)到最高為（84.8±1.2）分；但當(dāng)黑豆的比例繼續(xù)增加時(shí)黑豆米酒的感官評分則表現(xiàn)出下降的趨勢。黑豆經(jīng)發(fā)酵后產(chǎn)生的獨(dú)特香氣能克服單糧釀酒香氣單一的弱點(diǎn)，但黑豆比例過大后容易使酒體呈現(xiàn)出較強(qiáng)的豆腥味。因此選擇物料比（黑豆∶大米）為1∶3、1∶2、1∶1（g∶g）用于響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.2 料液比對黑豆米酒感官評分的影響

由圖2可知，當(dāng)料液比在1∶1.5～1∶3.0（g∶mL）范圍內(nèi)時(shí)，黑豆米酒的感官評分隨著純凈水比例的升高而升高，最高時(shí)可達(dá)（78.4±1.2）分；當(dāng)料液比達(dá)到1∶3.5（g∶mL）時(shí)，經(jīng)發(fā)酵后的黑豆米酒酒液的酒精體積分?jǐn)?shù)偏低，風(fēng)味較差，造成黑豆米酒的感官評分降為（74.1±1.4）分。因此選擇料液比為1∶2.5、1∶3.0、1∶3.5（g∶mL）用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 料液比對黑豆米酒感官評分的影響Fig.2 Effect of material to water ratio on sensory evaluation score of black bean rice wine

2.1.3 接種量對黑豆米酒感官評分的影響

圖3 接種量對黑豆米酒感官評分的影響Fig.3 Effect of inoculum on sensory evaluation score of black bean rice wine

由圖3可知，隨著接種量的逐漸增加，黑豆米酒的感官評分也隨之增加。由于接種量偏低時(shí)，容易使原料不能完全發(fā)酵，造成發(fā)酵液酒精體積分?jǐn)?shù)偏低及酒香不突出等現(xiàn)象。當(dāng)接種量達(dá)到2.5%時(shí)，黑豆米酒的感官評分達(dá)到了（82.2±1.3）分，但與接種量為2.0%時(shí)的感官評分無顯著性差異（P＞0.05），故選擇接種量為1.5%、2.0%、2.5%用于響應(yīng)面法試驗(yàn)。

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間對黑豆米酒感官評分的影響

圖4 發(fā)酵時(shí)間對黑豆米酒感官評分的影響Fig.4 Effect of fermentation time on sensory evaluation score of black bean rice wine

由圖4可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，糖分不斷轉(zhuǎn)化成乙醇及香味物質(zhì)，黑豆米酒的感官評分也隨之增加，發(fā)酵時(shí)間為21 d時(shí)，最高達(dá)到了（82.3±1.1）分。雖然當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為23 d時(shí)，黑豆米酒的感官評分較發(fā)酵時(shí)間為21 d時(shí)有所下降，但兩者之間無顯著性差異（P＞0.05）。因此選擇發(fā)酵時(shí)間為19 d、21 d、23 d用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

通過響應(yīng)面法對物料比、料液比、接種量、發(fā)酵時(shí)間4個(gè)因素分析得到以下試驗(yàn)方案及結(jié)果見表3。

表3 黑豆米酒發(fā)酵工藝條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experiments for black bean rice wine fermentation process optimization

通過Design-Expert 8.0.6軟件對表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到結(jié)果如表4所示。由表4可知，接種量與發(fā)酵時(shí)間對黑豆米酒感官評分影響極顯著（P＜0.01）。以黑豆米酒感官評分為響應(yīng)值，經(jīng)回歸擬合后，得到回歸方程：

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of the response surface experiments results

根據(jù)表4中方差分析結(jié)果，黑豆米酒感官評分的回歸方程描述與響應(yīng)面值之間的關(guān)系模型顯著（P＜0.05），且失擬項(xiàng)檢驗(yàn)不顯著（P＞0.05），表明該試驗(yàn)?zāi)Ｐ统浞謹(jǐn)M合試驗(yàn)數(shù)據(jù)，黑豆米酒感官評分的回歸方程是黑豆米酒感官評分與黑豆米酒釀造工藝各參數(shù)的合適數(shù)學(xué)模型，即可以利用此回歸方程確定黑豆米酒釀造的最佳工藝。

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對各試驗(yàn)因子所構(gòu)成的三維空間的曲面圖，從響應(yīng)面分析圖上可形象地看出最佳參數(shù)及各參數(shù)之間的相互作用[25]。根據(jù)黑豆米酒感官評分回歸方程得出不同因子的響應(yīng)面分析圖結(jié)果見圖5。由圖5可較直觀地看出，各因素交互作用對黑豆米酒感官評分的影響，若曲線越陡峭，則表明該因素對黑豆米酒感官評分的影響越大[26]。由圖5可知，因子C（接種量）對黑豆米酒感官評分的影響最大，因子D（發(fā)酵時(shí)間）次之，與表3方差分析結(jié)果相吻合，接種量和發(fā)酵時(shí)間二者對應(yīng)的P值均＜0.01，均達(dá)到了極顯著水平。

通過軟件分析確定黑豆米酒的最佳釀造工藝為物料比（黑豆∶大米）1∶1.49、料液比1∶2.94（g∶mL）、接種量2.26%及發(fā)酵時(shí)間20.75 d，此條件下由公式算出感官評分的理論值為90.93分。為方便實(shí)際操作，根據(jù)所得的分析數(shù)據(jù)進(jìn)行3組驗(yàn)證試驗(yàn)，修正驗(yàn)證試驗(yàn)的條件為物料比（黑豆∶大米）1∶1.5、料液比1∶3.0（g∶mL）、接種量2.3%及發(fā)酵時(shí)間21 d，在此條件下得到黑豆米酒的感官評分為91.5分，測定結(jié)果穩(wěn)定，偏差不大，證明該結(jié)果合理可靠。

圖5 物料比、料液比、接種量及發(fā)酵時(shí)間交互作用對黑豆米酒感官評分影響的等高線與響應(yīng)面曲Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between material ratio,material to water ratio,inoculum and fermentation time on the sensory evaluation score of black bean rice wine

2.3 理化指標(biāo)分析

經(jīng)測得黑豆米酒在最佳釀造工藝條件下的還原糖為4.3 g/100 g，酒精度11.7%vol，總酸0.89 g/100 g，固形物為11.3 g/100 g。理化指標(biāo)均符合NY/T 1885—2010《綠色食品米酒》中的標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上用響應(yīng)面法對黑豆米酒的釀造工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，影響黑豆米酒感官評分的工藝因素按主次順序排列為接種量＞發(fā)酵時(shí)間＞料液比＞物料比。最終確定了其最優(yōu)工藝條件為物料比（黑豆∶大米）1∶1.5、料液比1∶3.0（g∶mL）、接種量2.3%及發(fā)酵時(shí)間21 d，在此條件下黑豆米酒感官評分為91.5分，色澤玫紅、透明、糧香與酒香和諧。

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