王 姍 范修德 尹盼盼 王小云 許君望△

(1西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 西安 710061;2西安航天總醫(yī)院，西安 710100；3濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，濟(jì)寧 272029)

胃癌是全球常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，我國每年新發(fā)病例約40萬，占世界總發(fā)病例約42%[1]。基于胃癌的組織結(jié)構(gòu)和生物學(xué)行為的不同，將其分為腸型胃癌、彌漫型胃癌及混合型胃癌[2]。早期胃癌主要通過內(nèi)鏡下治療或手術(shù)治療，但多數(shù)患者在確診時已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，總體療效并不理想。胃癌患者一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移不僅預(yù)后差，而且嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量。近年來對于胃癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究結(jié)果顯示，腫瘤的浸潤及轉(zhuǎn)移是一個多步驟的涉及多種因素的復(fù)雜過程，如腫瘤細(xì)胞微環(huán)境中基質(zhì)的降解、免疫逃逸、細(xì)胞間黏附作用的喪失、細(xì)胞遷移能力的增強(qiáng)等。

高遷移率族蛋白(high mobility group box-1 protein,HMGB1)是細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的非組蛋白結(jié)合蛋白，作為損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)中的一員，當(dāng)分泌到細(xì)胞外時，主要發(fā)揮致炎作用，參與膿毒癥及自身免疫性疾病的致病過程[3]。研究發(fā)現(xiàn)HMGB1在胰腺癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤組織中高表達(dá)[4-5]，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起到了關(guān)鍵作用，既往研究認(rèn)為其作用機(jī)制可能通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展；近期研究發(fā)現(xiàn)HMGB1也可通過增強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6]。有研究發(fā)現(xiàn)HMGB1的血清學(xué)水平可作為早期診斷胃癌的標(biāo)志物[7]，其可促進(jìn)胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移；但也有研究發(fā)現(xiàn)高水平表達(dá)HMGB1的胃癌患者比低水平表達(dá)的胃癌患者預(yù)后較好[8]。因此本實驗擬聯(lián)合Oncomine數(shù)據(jù)庫和 Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫分析HMGB1在胃癌中的表達(dá)及其對預(yù)后的影響，為進(jìn)一步研究HMGB1在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制提供線索和思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

Oncomine數(shù)據(jù)庫分析：Oncomine數(shù)據(jù)庫(https://www.oncomine.org)既是一個基于基因芯片的數(shù)據(jù)庫，也是一個整合多個腫瘤基因數(shù)據(jù)庫的挖掘平臺，我們可以根據(jù)課題需要在此數(shù)據(jù)庫中設(shè)定篩選數(shù)據(jù)和挖掘數(shù)據(jù)的條件。本研究中我們?yōu)槊鞔_HMGB1在胃癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)水平，故設(shè)定的篩選條件為：1)“Cancer Type:Gastric Cancer”;2)“Gene:HMGB1”;3)“DataType:mRNA”;4)“Sample Type:Clinical Specimen”;5)“Analysis Type:Cancer vs Normal Analysis”;6)臨界值設(shè)定條件(Pvalue<1E-4，fold change>2,gene rank=top 10%)選擇柱狀圖展示結(jié)果。

1.2 方法

Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫進(jìn)行患者生存周期分析：利用 Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫(http://kmplot.com/analysis/)中的胃癌數(shù)據(jù)資料，在線分析HMGB1對胃癌患者預(yù)后的影響。篩選條件如下:1)“Cancer:Gastric Cancer”;2)“Gene:HMGB1”;3)“Survival:OS”;4)“Lauren classification:all/intstestinal/diffuse/mixed”。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

胃癌組織和癌旁正常組織之間的HMGB1表達(dá)水平的差異采用t檢驗。HMGB1的表達(dá)水平與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系采用Kaplan-Meier模型分析。所用數(shù)據(jù)采用Oncomine數(shù)據(jù)庫和Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫在線統(tǒng)計學(xué)分析，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HMGB1在所有腫瘤類型中的表達(dá)結(jié)果

在Oncomine 數(shù)據(jù)庫中共收集了443項不同類型的研究結(jié)果，其中關(guān)于HMGB1表達(dá)有統(tǒng)計學(xué)差異的研究結(jié)果有20項，HMGB1表達(dá)增高的研究有17項，表達(dá)降低的研究有3項。在消化系統(tǒng)腫瘤組織中，結(jié)腸癌組織中，HMGB1高水平表達(dá)的研究有5項，低水平表達(dá)的研究有0項；胃癌組織中，HMGB1高水平表達(dá)的研究有1項，低水平表達(dá)的研究有0項；食管癌組織中，HMGB1的表達(dá)沒有差異。見圖1。

2.2 HMGB1在Oncomine數(shù)據(jù)庫中胃癌中的表達(dá)結(jié)果

Oncomine 數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，共有11項研究涉及HMGB1在胃癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)，共包括318個樣本，薈萃11項研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)與癌旁正常組織相比，HMGB1在胃癌組織中高水平表達(dá)(P=0.002)。見圖2。

2.3 HMGB1在不同胃癌研究芯片中癌組織和正常組織之間的表達(dá)差異

Oncomine 數(shù)據(jù)庫中HMGB1在不同胃癌組織芯片中的表達(dá)結(jié)果顯示，在4項研究中HMGB1在胃癌組織中的表達(dá)量高于癌旁正常組織(P均<0.05),但是在腸型、彌漫性及混合型胃癌組織之間，HMGB1的表達(dá)量并無顯著性差別。見圖3。

圖1 Oncomine數(shù)據(jù)庫中HMGB1在所有腫瘤研究中的表達(dá)

圖2 HMBG1在Oncomine數(shù)據(jù)庫中胃癌中的表達(dá)

2.4 HMGB1和胃癌預(yù)后的關(guān)系

我們利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫的胃癌數(shù)據(jù)集進(jìn)行在線生存分析。Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)結(jié)果顯示：HMGB1表達(dá)水平對患者的總生存時間有較大的影響。與低表達(dá)組相比，HMGB1高表達(dá)組胃癌患者的總存活時間有所延長(P=1.8E-05)，同樣HMGB1的表達(dá)水平對腸型胃癌患者(P=6.6E-08)也具有同樣的影響；但是對于彌漫型胃癌和混合型胃癌，HMGB1的表達(dá)水平與胃癌患者的預(yù)后并無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性(P=0.16和P=0.075)。見圖4。

圖3 Oncomine數(shù)據(jù)庫中HMGB1在不同胃癌研究芯片中的表達(dá)(P均<0.05)

圖4 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析HMBG1對胃癌患者預(yù)后的影響

3 討論

胃癌由于起病隱匿、病情發(fā)展迅速、較高的手術(shù)復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率高等特點，中晚期胃癌的治療效果并不理想。流行學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，全球胃癌新發(fā)病例約67.9萬例，胃癌死亡病例約49.8萬例，超過70%的胃癌新發(fā)病例發(fā)生在發(fā)展中國家，約50%的病例發(fā)生在東亞地區(qū)，主要集中在日本、中國和韓國[1]。我國作為胃癌高發(fā)國家，每年發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)約占世界的50%，疾病負(fù)擔(dān)嚴(yán)重，故現(xiàn)在迫切需要探索新的有效治療途徑和方法。

HMGB1因其在聚丙烯酰胺凝膠中遷移速率快而得名[3,9]。HMGB1廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)，同染色體DNA非特異結(jié)合，它屬于HMG家族一員，在細(xì)胞內(nèi)，HMGB1自由穿梭于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間，在線粒體、溶酶體、細(xì)胞膜以及細(xì)胞外基質(zhì)中均可見HMGB1分布。在細(xì)胞核內(nèi)，HMGB1參與調(diào)控DNA的復(fù)制、重組及修復(fù)過程。HMGB1通過A box和B box和不同構(gòu)象的DNA結(jié)合，而且這種結(jié)合是結(jié)構(gòu)特異性而非序列特異性[10]。HMGB1廣泛存在于各組織，生理情況下在脾臟和胸腺中含量較高，隨著年齡的增長，HMGB1的水平呈下降趨勢。近些年來研究發(fā)現(xiàn)HMGBl在胰腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌、乳腺癌等多種腫瘤中存在高表達(dá)，HMGBl可能與部分腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4-5,7]，也有研究發(fā)現(xiàn)HMGBl可能通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[8]，這提示我們HMGB1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著“雙刃劍”的角色。

HMBG1影響腫瘤的生物學(xué)機(jī)制目前尚未明確，其分子機(jī)制可能是腫瘤炎性微環(huán)境中的白細(xì)胞主動分泌到細(xì)胞外的HMBG1和壞死的腫瘤細(xì)胞被動釋放的HMBG1可能通過與受體RAGE(receptor for advanced glycation end products)結(jié)合激活ERK-1/2等信號通路，繼而引起基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2和MMP9激活，直接誘導(dǎo)細(xì)胞運(yùn)動和間接促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解，參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[11]；而且HMGB1與腫瘤血管生成有關(guān)，HMGB1及其受體RAGE的結(jié)合會導(dǎo)致 NF-κB的激活，進(jìn)而使白細(xì)胞黏附分子和前炎癥反應(yīng)分子及血管生成因子表達(dá)上調(diào)[12-13]；HMGB1與肝素形成的復(fù)合物也能促進(jìn)血管生成，在體內(nèi)外實驗中，人們利用抗體封閉HMGB1后，發(fā)現(xiàn)血管生成受到抑制[4]，這些研究均提示HMGBl參與了腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。但是研究發(fā)現(xiàn)HMGB1也有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的可能性，其機(jī)制可能與其誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫有關(guān)，HMGB1可誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞成熟，通過改變其表面分子的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌；也可以通過成熟的樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞向Th1分化，增強(qiáng)T細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)；這些作用均有望增強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6,8]。

在本文中，我們用Oncomine數(shù)據(jù)庫提取HMGB1基因在胃癌組織及正常組織中的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示HMGB1表達(dá)在胃癌組織中高于正常組織。而且通過對Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫的胃癌數(shù)據(jù)集進(jìn)行在線生存分析，我們發(fā)現(xiàn)HMGB1高表達(dá)可延長胃癌患者的存活時間，提示HMBG1的表達(dá)升高可能是胃癌患者預(yù)后良好的因素，但是本文只針對mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行了分析，缺乏對蛋白水平的進(jìn)一步分析，而且本文只是采用數(shù)據(jù)庫進(jìn)行大樣本分析，缺乏對相關(guān)生物學(xué)機(jī)制的基礎(chǔ)研究，仍需要更多基于HMBG1表達(dá)與胃癌預(yù)后的研究進(jìn)一步驗證二者關(guān)系。

綜上所述，我們通過對胃癌組織中HMBG1相關(guān)信息的深入挖掘，提出HMBG1在胃癌組織中高表達(dá)，且與胃癌預(yù)后相關(guān)，HMBG1的表達(dá)在一定程度上可用作反映胃癌預(yù)后的重要生物學(xué)指標(biāo)。本文結(jié)果為探索HMBG1在胃癌中的作用提供基礎(chǔ)，對今后胃癌的臨床治療和預(yù)后研究提供重要理論依據(jù)。

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