張海洋　賴春芬　閆苗

摘要：以秀珍菇（Pleurotus geesteranus）廢菌糠為試驗(yàn)材料，采用浸提法提取漆酶，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合正交試驗(yàn)利用噴霧干燥技術(shù)將獲得的粗酶液制成酶制劑，研究漆酶提取及其酶制劑制備的最佳工藝條件。結(jié)果表明，最佳提取條件為磨料30 s，料液比1∶10（g∶mL），提取時(shí)間30 min，轉(zhuǎn)速160 r/min，溫度25 ℃。優(yōu)化后噴霧干燥條件為進(jìn)風(fēng)溫度95 ℃，熱風(fēng)流量3.5 m3/min，進(jìn)料速度20 mL/min。該工藝可為大規(guī)模利用秀珍菇廢菌糠生產(chǎn)制備漆酶酶制劑提供參考。

關(guān)鍵詞：秀珍菇（Pleurotus geesteranus）；廢菌糠；漆酶；噴霧干燥；酶制劑

中圖分類號(hào)：S646 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2018）03-0081-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.03.019

Abstract： The fungi chaff of Pleurotus geesteranus were used to explore the spray drying conditions of laccase extract. And laccase preparation were optimized by orthogonal tests on the basis of single factor experiments. The results indicated that the optimal extraction conditions were crush time of 30 s，solid-liquid ratio of 1∶10（g∶mL），extraction time of 30 min，shaking speed of 160 r/min and extraction temperature of 25 ℃. The optimal spray drying conditions were as follows：inlet air temperature 95 ℃，flux rate 20 mL/min，hot air flow 3.5 m3/min. This study would provide a reference basis for the production of large scale production of laccase from Pleurotus geesteranus chaff.

Key words： Pleurotus geesteranus；fungi chaff；laccase；spray drying；enzyme preparation

秀珍菇（Pleurotus geesteranus）又名環(huán)柄香菇，朵形嬌小、味道鮮美、營養(yǎng)豐富，深受廣大消費(fèi)者喜愛，是中國重要的經(jīng)濟(jì)農(nóng)作物之一[1]。隨著秀珍菇產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展，每年產(chǎn)生大量的廢菌糠，且呈逐年增加的趨勢，目前大多廢菌糠被隨意丟棄、焚燒，不僅浪費(fèi)資源，而且污染環(huán)境、破壞生態(tài)平衡。如何處理廢菌糠已經(jīng)成為亟待解決的問題[2-4]。據(jù)研究報(bào)道，秀珍菇收獲后的廢菌糠中仍含有漆酶（Laccase）、木聚糖酶、蛋白酶等豐富的生物酶[5，6]。其中漆酶屬于藍(lán)色多銅氧化酶家族[7]，是木質(zhì)素降解酶之一，用途廣泛。劉曉貞等[8]利用殼聚糖固定漆酶發(fā)現(xiàn)對2，4-二氯苯酚降解效果良好；林先貴[9]的研究表明，真菌漆酶可以轉(zhuǎn)化多種有機(jī)污染物、修復(fù)土壤；Smith等[10]利用DEAE-纖維素固定漆酶制成傳感器用以檢測茶酚；Fei等[11]從1株白腐菌中分離出1個(gè)新的漆酶并應(yīng)用于染料降解。目前，漆酶的產(chǎn)量不理想，生產(chǎn)成本高，離工廠化生產(chǎn)漆酶仍有較大的距離，限制了漆酶的應(yīng)用。國內(nèi)對漆酶產(chǎn)生菌研究多集中在白腐真菌，秀珍菇作為白腐真菌中漆酶產(chǎn)量較高的一類[12]，從秀珍菇廢菌糠中高效提取制備漆酶酶制劑，不僅能夠拓寬漆酶來源，同時(shí)能夠增加廢菌糠的附加值，促進(jìn)秀珍菇產(chǎn)業(yè)的良性循環(huán)。

由于液態(tài)漆酶穩(wěn)定性較差，難以長期保存，為提高其穩(wěn)定性，使其便于貯藏和運(yùn)輸，通常需要將其制備成干燥的固體酶制劑[13、14]。本試驗(yàn)以秀珍菇廢菌糠（主要成分為30%棉籽殼、30%細(xì)木屑）為原料，采用浸提法對漆酶的提取工藝進(jìn)行了初步探索，并利用提取后的粗酶液，對噴霧干燥法制備漆酶酶制劑的工藝進(jìn)行研究，以期得到符合工廠化應(yīng)用要求的漆酶酶制劑，為廢菌糠的開發(fā)應(yīng)用拓寬方向。

1 材料與方法

1.1 漆酶粗酶液的提取

在其他提取條件一致的情況下，分別選取不同浸提液（水、醋酸鈉緩沖液、丙二酸緩沖液、酒石酸緩沖液、檸檬酸-磷酸緩沖液），磨料時(shí)間（未磨碎、30、60、90、120 s），不同料液比（1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14，g∶mL，下同），不同提取溫度（15、20、25、30、35 ℃），不同提取時(shí)間（0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h），不同的搖床轉(zhuǎn)速（100、120、140、160、180、200 r/min）進(jìn)行漆酶粗酶液提取，并測定酶活力。

1.2 酶制劑的制備

1.2.1 單因素試驗(yàn) 在其他條件一致的情況下，分別選擇不同進(jìn)風(fēng)溫度（95、105、115、125、135、145、155、165、175、185 ℃），進(jìn)料速度（10、15、20、25、30、35 mL/min），熱風(fēng)流量（1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 m3/min）對粗酶液進(jìn)行噴霧干燥制成酶制劑，并測定酶活力。

1.2.2 正交試驗(yàn) 在分析各因素對噴霧干燥效果影響的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對較優(yōu)的噴霧干燥參數(shù)以酶活為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)方法進(jìn)行優(yōu)化。

1.3 漆酶酶活力的測定

準(zhǔn)確移取HAc-NaAc緩沖液（pH=4.5）2.7 mL、1 mmol/L ABTS溶液0.2 mL，混合搖勻，在30 ℃恒溫水浴鍋中水浴預(yù)熱5 min。準(zhǔn)確加入待測酶液 100 μL，于30 ℃恒溫水浴鍋水浴30 min，用分光光度計(jì)測定其在420 nm處的吸光度，420 nm處ABTS摩爾吸光系數(shù)為36 000 L/mol·cm。

2 結(jié)果與分析

2.1 漆酶提取的優(yōu)化結(jié)果

為提高酶的提取效率，減少各種因素引起的酶活損失，應(yīng)選擇最適宜的條件進(jìn)行提取。對漆酶的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見圖1。由圖1A可知，不同浸提液對提取的漆酶酶活影響較小，以檸檬酸-磷酸緩沖液作為浸提液時(shí)，效果略優(yōu)于其他提取液，酶活達(dá)0.44 U/g，其次是水，以水為浸提液的漆酶酶活也達(dá)到0.32 U/g。由圖1B可知，磨料時(shí)間對漆酶酶活也有一定的影響，漆酶酶活隨著磨料時(shí)間的延長而升高，在30 s時(shí)，酶活達(dá)0.38 U/g。由圖1C可知，隨著液料比的增大，漆酶酶活逐漸升高，當(dāng)料液比為1∶10時(shí)酶活達(dá)到0.301 U/g，當(dāng)料液比高于1∶10時(shí)，提取液中漆酶酶活變化不大，且有下降的趨勢。由圖1D可知，隨著溫度的增加，漆酶酶活呈先升高后降低的趨勢。當(dāng)溫度為25 ℃時(shí)，漆酶酶活達(dá)到峰值為0.17 U/g。從圖1E可以看出，在提取時(shí)間為0～30 min時(shí)漆酶酶活迅速升高，由0.17 U/g上升到0.26 U/g，酶活在30～90 min變化不明顯，90 min時(shí)達(dá)到峰值為0.28 U/g；在90～150 min時(shí)，漆酶酶活逐漸下降。由圖1F可得，隨著搖床轉(zhuǎn)速的提高，漆酶酶活也逐漸增大，在搖床轉(zhuǎn)速為100～160 r/min條件下，漆酶酶活上升趨勢明顯，在160 r/min時(shí)酶活達(dá)0.25 U/g，在160～200 r/min時(shí)上升趨勢不明顯，到后期甚至有下降的現(xiàn)象。

2.2 噴霧干燥單因素條件優(yōu)化結(jié)果

固體酶制劑干燥工藝中，噴霧干燥因受熱時(shí)間短、酶活損失小、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。制備工藝佳、品質(zhì)優(yōu)的酶制劑需要調(diào)控好進(jìn)風(fēng)溫度、進(jìn)料速度、熱風(fēng)流量3個(gè)重要的工藝參數(shù)。本研究利用噴霧干燥技術(shù)制備漆酶酶制劑，對3個(gè)參數(shù)的優(yōu)化結(jié)果如圖2所示。

從圖2A可得，隨著溫度的升高，漆酶酶活逐漸降低，且降低的速率較快，進(jìn)風(fēng)溫度低于95 ℃時(shí)不易形成干粉，當(dāng)進(jìn)風(fēng)溫度為105 ℃時(shí)漆酶酶制劑的酶活最大，達(dá)到了4.20 U/g，故選用105 ℃為較佳的進(jìn)風(fēng)溫度。從圖2B可知，在進(jìn)料速度10～15.0 mL/min，干粉的酶活呈快速增長，且在15.0 mL/min時(shí)達(dá)到了最大值4.95 U/g，隨后酶活基本保持不變?？偯富钤谶M(jìn)料速度15.0 mL/min時(shí)達(dá)到最大值為1.43 U，之后總酶活呈快速下降的趨勢，表明進(jìn)料速度對干粉的得率具有重要的作用。綜合考慮，酶制劑的酶活及總酶活在進(jìn)料速度為15.0 mL/min時(shí)都能達(dá)到最大，故選用15.0 mL/min為較佳的進(jìn)料速度。從圖2C可知，隨熱風(fēng)流量的增大，漆酶酶制劑的酶活變化不明顯，而其總酶活隨著熱風(fēng)流量的增加呈先上升后下降的趨勢，且在3.0 m3/min時(shí)達(dá)到最大值2.57 U，因而，選用熱風(fēng)流量為3.0 m3/min。

2.3 噴霧干燥正交試驗(yàn)結(jié)果

為進(jìn)一步優(yōu)化漆酶酶制劑的噴霧干燥工藝條件，選取了進(jìn)風(fēng)溫度、進(jìn)料速度、熱風(fēng)流量為考察因素，其中各操作因素的水平數(shù)選定以單因素試驗(yàn)結(jié)果和已有的研究為基礎(chǔ)，確定因素的水平范圍為進(jìn)風(fēng)溫度95～115 ℃、進(jìn)料速度10～20 mL/min、熱風(fēng)流量2.5～3.5 m3/min進(jìn)行L9 33正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表1）。

由表1可知，熱風(fēng)流量對酶制劑酶活的影響最大，其次為進(jìn)料速度，進(jìn)風(fēng)溫度的影響相對較小。綜合分析，確定試驗(yàn)3（即進(jìn)風(fēng)溫度95 ℃，進(jìn)料速度20 mL/min，熱風(fēng)流量3.5 m3/min）為漆酶粗酶液的噴霧干燥最佳工藝，在該條件下，制成的漆酶干粉酶制劑的總酶活可達(dá)2.65 U。

3 結(jié)論與討論

漆酶是一類具有高效催化功能的銅藍(lán)氧化酶，酶活力容易受到時(shí)間、溫度、溶劑等的影響[15]，在噴霧干燥制備成干粉酶制劑時(shí)，必須調(diào)整適宜的溫度、進(jìn)料速度和熱風(fēng)流量才能減少處理過程中對酶制劑的酶活力造成的損失[16]。

本研究通過單因素試驗(yàn)對漆酶的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，確定了從秀珍菇廢菌糠中提取漆酶的最佳條件為磨料時(shí)間30 s，料液比1∶10，提取時(shí)間30 min，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，提取溫度25 ℃，在該條件下提取的漆酶酶活達(dá)0.38 U/g。同時(shí)利用噴霧干燥技術(shù)將粗酶液制備成干粉酶制劑，并對噴霧干燥制備漆酶酶制劑的條件進(jìn)行優(yōu)化。以進(jìn)風(fēng)溫度、熱風(fēng)流量、進(jìn)料速度對噴霧干燥條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)，初步確定了各因素的最適范圍。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)一步優(yōu)化，3個(gè)因素對制成的酶制劑的影響大小依次是熱風(fēng)流量>進(jìn)料速度>進(jìn)風(fēng)溫度。在最佳工藝條件下（進(jìn)風(fēng)溫度95 ℃，進(jìn)料速度20 mL/min，熱風(fēng)流量3.5 m3/min），制得總酶活達(dá)2.65 U的漆酶干粉制劑。

國內(nèi)外市場漆酶缺口大、生產(chǎn)成本高[17-19]，因此利用食用菌廢菌糠提取制備漆酶酶制劑具有來源豐富、價(jià)格低廉等優(yōu)勢，不僅能夠制備大量的漆酶，同時(shí)將菌糠變廢為寶，增加食用菌行業(yè)的收入。

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