張杰 洪寅 盛振華 廖廣輝 管家齊 王曉倩 張廣順

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 杭州 310053 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)分析測試中心

介類中藥是指以動物的甲、殼入藥的一類中藥，多為貝類，其中以殼入藥的主要有牡蠣、石決明、瓦楞子等[1]。牡蠣、石決明和瓦楞子藥性咸、寒或平，入肝經(jīng)；石決明具有平肝潛陽的功效，瓦楞子可軟堅散結(jié)，而牡蠣同時具有平肝潛陽和軟堅散結(jié)兩種功效[2-4]。研究證實，牡蠣、石決明、瓦楞子三種介類中藥煅品較生品的咸寒之性降低，具有收斂固澀、制酸止痛的功效，用于胃痛泛酸等[2]。

目前中國藥典對介類中藥的質(zhì)量控制主要以CaCO3含量作為指標(biāo)，多數(shù)學(xué)者對介類中藥的研究也主要集中在CaCO3含量評價方面[5-7]，但其它無機(jī)元素（包括常量元素和微量元素），也是介類中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的重要組成部分，與中藥藥性、功效密切相關(guān)，在中藥質(zhì)量控制和藥效研究中起著重要的作用[8]。

介類中藥的傳統(tǒng)給藥方式是水煎口服，進(jìn)入人體的成分以水煎液中成分為主，故探討其水煎液中無機(jī)元素的含量具有重要意義。本研究以微波消解法進(jìn)行樣品前處理，電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜（inductively coupled plasma optical emission spectrometry，ICP-OES）法測定牡蠣、石決明、瓦楞子三種介類中藥的生、煅品水煎液中的11種無機(jī)元素，即Ca、Mg、Fe、K、Cu、Zn、Mn、Co、Mo、Se、Cr的含量，初步探究三種介類中藥生、煅品水煎液中無機(jī)元素與藥物性效的關(guān)聯(lián)性。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Thermo scientific ICAP6000電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀為美國熱電公司產(chǎn)品；CEM Mars 240/50型微波消解儀為美國CEM公司產(chǎn)品；Millipore mili-Q超純水器為美國Millipore公司產(chǎn)品；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式真空泵購于鞏義市英峪高科儀器廠；BSA124S-CW分析天平為北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；KSW電阻爐溫度控制器由沈陽市節(jié)能電爐廠制造。

1.2 試劑 Ca標(biāo)準(zhǔn)品溶液（批號：101508，濃度：500 mg·L-1），Cu標(biāo)準(zhǔn)品溶液（批號：100508，濃度：1 000 mg·L-1），F(xiàn)e標(biāo)準(zhǔn)品溶液（批號102407，濃度：1 000 mg·L-1），Zn 標(biāo)準(zhǔn)品溶液（批號：100906，濃度：1 000 mg·L-1），Mn 標(biāo)準(zhǔn)品溶液（批號：102606，濃度：1 000 mg·L-1），上述元素標(biāo)準(zhǔn)品溶液均由環(huán)境保護(hù)部標(biāo)準(zhǔn)樣品研究所提供；K 標(biāo)準(zhǔn)品溶液（批號：15104，濃度：1 000μg·mL-1），Mg 標(biāo)準(zhǔn)品溶液（批號：15114，濃度：1 000μg·mL-1），Co 標(biāo)準(zhǔn)品溶液（批號：12072，濃度：1 000μg·mL-1），Se標(biāo)準(zhǔn)品溶液（批號：16063，濃度：100μg·mL-1），Mo 標(biāo)準(zhǔn)品溶液（批號：15111，濃度：100μg·mL-1），Cr標(biāo)準(zhǔn)品溶液（批號：16041，濃度：1 000μg·mL-1），上述元素標(biāo)準(zhǔn)品溶液均由中國計量科學(xué)研究所提供；硝酸購于上海凌峰化學(xué)試劑有限公司（優(yōu)級純，批號：20131011）。

1.3 藥材 牡蠣生品（產(chǎn)地：浙江，批號：160901），石決明生品（產(chǎn)地：廣東，批號：160401），均購于浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠。瓦楞子生品（產(chǎn)地：浙江，批號：20160601），購于浙江百草中藥飲片有限公司。藥材經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院宋捷民教授鑒定，牡蠣為牡蠣科動物近江牡蠣（Ostrea rivularis Gould）的貝殼；石決明為鮑科動物雜色鮑（Haliotis diversicolor Reeve）的貝殼；瓦楞子為蚶科動物毛蚶（Arca subcrenata Lischke）的貝殼。

2 方法

2.1 煅品制備 將牡蠣、石決明、瓦楞子生品分別洗凈、曬干，按照2015版《中國藥典》炮制通則項下明煅法[9]，將三者生品分別砸成小塊，置于馬弗爐中明煅（500℃，30min）至灰白色無光澤、質(zhì)酥脆，取出、冷卻后取得三者煅品。

2.2 水煎液樣品的制備 將牡蠣、石決明和瓦楞子生、煅品粉碎后過7號篩，精密稱取粉末各20g，分別煎煮。各樣品粉末先加入6倍量水冷浸30min，煮沸后保持微沸45min，趁熱抽濾；再加入4倍量水，保持微沸30min，趁熱抽濾；合并兩次濾液并濃縮。

2.3 供試品溶液的制備 分別精密量取三種介類中藥的生、煅水煎液樣品4mL，置于聚四氟乙烯微波消解罐中，加入5mL硝酸，加蓋搖勻后放入微波消解儀，按表1程序進(jìn)行消解。在通風(fēng)櫥中操作，揮去余酸，消解完畢后冷卻至室溫，取出消解罐，將消解液轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶，用超純水洗滌消解罐3次，洗滌液合并于容量瓶中并定容到刻度線，搖勻，得供試品溶液。另取5mL的硝酸按同樣方法進(jìn)行處理，作為空白溶液備用。

表1 微波消解儀工作條件Tab.1 Procedure of microwave digestion

2.4 系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備 將購得的各元素標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為貯備液。分別精密量取 Mg、Fe、K、Cu、Zn、Mn、Co、Mo、Se、Cr 貯 備 液 0.025mL、0.05mL、0.5mL、1.5mL、2.5mL，分別置于50mL量瓶中，加1%硝酸定容，作為 Mg、Fe、K、Cu、Zn、Mn、Co、Mo、Se、Cr系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液；精密量取 Ca貯備液 0.05mL、0.2mL、0.8mL、1.6mL、2.5mL分別置于50mL量瓶中，加1%硝酸定容，作為Ca系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，備用。

2.5 ICP-OES儀器工作條件 射頻功率：1 150W；樣品沖洗時間：30s，重復(fù) 3 次；泵速：50r/min；輔助氣流速：0.5L·min-1；Camera 溫度：-46.17℃；發(fā)生器溫度：26℃；光室溫度：38℃；以低波長范圍水平 15s，垂直15s；高波長范圍水平5s，垂直5s為分析最大積分時間。

2.6 方法學(xué)考察 本研究嚴(yán)格進(jìn)行了相關(guān)方法學(xué)考察，相對精密度（relative standard deviation，RSD）≤2.14%、檢出限（0.0002～2.3478）ng·L-1、加樣回收率87.6%～101.2%，結(jié)果均在合格范圍，證明該測定方法穩(wěn)定可靠。見表2。

表2 元素波長、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、相對精密度和檢出限Tab.2 Element wavelength，linear regression equation，correlation coefficient，relative standard deviation and detection limit

2.7 樣品含量測定 取2.3項下各供試品溶液按2.5項下儀器條件分別進(jìn)樣，每個樣品溶液平行測定3次，得到牡蠣、石決明和瓦楞子生、煅品水煎液中各元素含量測定結(jié)果，并采用GraphPad Prism 6軟件作圖。

2.8 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以±s表示，同一介類中藥生品與煅品之間比較采用配對t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 含量測定結(jié)果及分析

3.1 三種介類中藥生品水煎液中無機(jī)元素含量比較三種介類中藥生品水煎液中Ca、Mg、K元素含量均較為豐富，其中牡蠣生品水煎液中各無機(jī)元素含量順序：Ca＞Mg＞K＞Mn＞Fe＞Cu＞Zn＞Se（Cr）＞Mo（Co），石決明生品水煎液中各無機(jī)元素含量順序：Ca＞Mg＞K＞Mn＞Fe＞Zn＞Cu＞Se（Cr）＞Mo（Co），瓦楞子生品水煎液中各無機(jī)元素含量順序：Ca＞Mg＞K＞Mn＞Fe＞Cu＞Zn＞Se（Cr）＞Mo（Co）。牡蠣和石決明生品水煎液中 Mg、Mn、Fe元素含量約為瓦楞子生品水煎液中的2倍。見表3。

3.2 三種介類中藥生、煅品水煎液中無機(jī)元素含量比較 三種介類中藥煅品水煎液中，Ca元素含量均較各自生品水煎液增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），K、Se、Cr元素較各生品水煎液含量無明顯差異（P＞0.05）。與生品水煎液比較，三種介類中藥煅品水煎液中 Mg、Mn、Fe、Cu、Zn、Mo、Co 元素含量變化差異較大。見表3、圖1。

4 討論

中藥功效取決于其內(nèi)在成分，中藥無機(jī)元素的種類及含量是決定中藥性味、功效的主要因素之一[10-11]。盛良[12]認(rèn)為無機(jī)元素具有寒、熱、溫、涼四性，元素的四性與元素原子的電子得失相關(guān)，進(jìn)而影響到由元素單質(zhì)或化合物組成的中藥性味和功效。本研究發(fā)現(xiàn)，牡蠣、石決明、瓦楞子三種介類中藥生品水煎液中各無機(jī)元素種類和含量高低順序具有大致相同的趨勢：Ca＞Mg＞K＞Mn＞Fe＞Cu 或 Zn＞Se（Cr）＞Mo（Co），而三者生品藥性相近，都為咸、寒或平，說明該類中藥藥性可能受無機(jī)元素的種類和含量影響。牡蠣、石決明水煎液中 Mg、Mn、Fe 含量高于瓦楞子水煎液，Mg、Mn、Fe與平肝潛陽功效相關(guān)[13]，牡蠣、石決明較瓦楞子平肝潛陽功效更強(qiáng)，可能與Mg、Mn、Fe元素含量更高有關(guān)。Mg、Mn、Fe可以作為機(jī)體重要輔酶的組分，參與機(jī)體的物質(zhì)代謝和免疫力調(diào)節(jié)過程。其中Fe有促進(jìn)造血機(jī)能和抑制膽固醇合成的作用，Mn可以改善動脈硬化患者的脂質(zhì)代謝，Mn、Fe含量豐富的中藥常用于高血壓治療[13-14]。此外，楊柳等[15]指出石膏中豐富的

無機(jī)元素與其清熱的功效相關(guān)，其中Fe、Cu、Ti具有抗感染作用，可增加機(jī)體免疫功能。羅琴等[16]對方桿蕨中無機(jī)元素與藥性的關(guān)系作了初步分析，認(rèn)為高Fe低Mn是方桿蕨清熱解毒的物質(zhì)基礎(chǔ)，Zn、Cu含量的比值則與活血化瘀功效相關(guān)。

表3 三種介類中藥生、煅品水煎液中無機(jī)元素的含量（±s，μg·mL-1）Tab.3 The content of mineral elements in the decoction of three testacean TCM and calcined products(±s，μg·mL-1)

表3 三種介類中藥生、煅品水煎液中無機(jī)元素的含量（±s，μg·mL-1）Tab.3 The content of mineral elements in the decoction of three testacean TCM and calcined products(±s，μg·mL-1)

注：“-”表示未檢測到該元素。與同一藥物生品水煎液比較，*P＜0.05。Note:“-”indicates that the element is not detected.Compared with calcined products，*P＜0.05.

無機(jī)元素 牡蠣 煅牡蠣 石決明 煅石決明 瓦楞子 煅瓦楞子Ca Mg K Mn Fe Cu Zn Se Cr Co Mo 27.13±0.70 9.19±0.14 3.75±0.12 1.25±0.12 0.77±0.02 0.41±0.01 0.13±0.01 0.04±0.003 0.03±0.001 0.01±0.003 0.01±0.002 33.71±1.25*12.43±0.20*4.12±0.07 2.43±0.01*0.81±0.05 0.46±0.01 0.43±0.02*0.04±0.002 0.05±0.03 0.01±0.003 0.01±0.03 30.97±0.36 12.77±0.06 2.36±0.04 1.14±0.03 0.88±0.01 0.10±0.003 0.18±0.002 0.04±0.001 0.04±0.003 0.01±0.003 0.02±0.001 35.65±0.67*11.90±0.02 2.14±0.01 1.15±0.003 1.7±0.01*0.32±0.003*0.23±0.01 0.04±0.002 0.04±0.001 0.01±0.003 0.17±0.005*28.49±0.11 4.51±0.02 2.44±0.06 0.68±0.001 0.24±0.07 0.16±0.004 0.13±0.002 0.050±0.03 0.033±0.14 0.003±0.001-32.86±0.23*2.93±0.06*2.34±0.06 0.51±0.007 0.56±0.01*0.13±0.001 0.15±0.001 0.07±0.002 0.04±0.002 0.01±0.003*-

圖1 三種介類中藥生、煅品水煎液中無機(jī)元素的含量比較Fig.1 Comparison of the content of mineral elements in the decoction of three testacean TCM and calcined products

有研究證實，中藥藥性與炮制前后無機(jī)元素的含量變化有關(guān)，炮制后無機(jī)元素含量減少使藥性趨于寒涼，而含量增加使藥性趨于溫?zé)醄17]。三種介類中藥煅品水煎液中各無機(jī)元素含量較各自生品水煎液發(fā)生不同變化。Ca作為含量最高的元素，在三種介類中藥煅品水煎液中含量均有所增高。Ca與制酸止痛、收斂固澀相關(guān)，可以降低毛細(xì)血管的通透性，有效防止血漿滲出，用于治療由胃酸過多引起的胃潰瘍、胃炎等疾病[13，18]。牡蠣、石決明、瓦楞子三種介類中藥煅品較生品的寒涼性降低，多用于制酸止痛、收斂固澀，可能與其中主要無機(jī)元素Ca的含量增高有關(guān)，由元素含量變化引起的性效改變與該類中藥藥性、功效及臨床應(yīng)用基本相符合。

目前對介類中藥研究相對薄弱，對介類中藥無機(jī)元素含量與性效的關(guān)系也未見詳細(xì)報道。本文通過比較牡蠣、石決明、瓦楞子三種介類中藥生、煅品水煎液中無機(jī)元素種類和含量，發(fā)現(xiàn)三種介類中藥生、煅品的性效差異可能與無機(jī)元素種類和含量的差異相關(guān)，對于研究介類中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)具有重要意義，為研究該類中藥藥性開辟了新途徑。無機(jī)元素的變化對中藥功效的影響相關(guān)機(jī)制尚不明確，需要進(jìn)一步探索，介類中藥生、煅品的性效差異與無機(jī)元素的相關(guān)性也有待進(jìn)一步的藥效學(xué)研究。

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