沈彤，張賽，涂悅，陳旭義，吳煥成

[1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 推拿科，天津 300193；2.武警后勤學(xué)院

附屬醫(yī)院腦科中心（天津市神經(jīng)創(chuàng)傷修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室），天津 300162；3.天津市北辰醫(yī)院 腦系科，天津 300400]

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)、交通運(yùn)輸業(yè)等的快速發(fā)展，顱腦創(chuàng)傷（traumatic brain injury，TBI）的發(fā)生率也逐年增高，其高致殘率和致死率給社會(huì)和家庭可造成嚴(yán)重負(fù)擔(dān)。而TBI后的繼發(fā)性腦水腫是導(dǎo)致患者殘疾和死亡的重要原因之一，因此有效控制腦水腫是治療TBI的關(guān)鍵手段[1]。近年有研究顯示，十二井穴放血對(duì)改善TBI后腦水腫有一定療效，但相關(guān)機(jī)制尚不明確。線粒體是機(jī)體能量代謝的重要場(chǎng)所，線粒體功能障礙與細(xì)胞毒性腦水腫以及神經(jīng)功能損傷程度密切相關(guān)，這提示線粒體或許是井穴放血療法發(fā)揮腦保護(hù)作用的重要靶點(diǎn)之一[2-4]。本實(shí)驗(yàn)擬通過皮質(zhì)撞擊致傷（controlled cortical impact injury，CCI）構(gòu)建不同損傷程度TBI大鼠模型，探討井穴放血療法對(duì)腦水腫的影響，并進(jìn)一步檢測(cè)線粒體生物合成相關(guān)基因表達(dá)以及線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）拷貝數(shù)的變化，從而為研究井穴放血療法治療TBI的機(jī)制提供更多基礎(chǔ)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雄性SD大鼠56只，7～8周齡，體重220～250 g，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。RNA/DNA共提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司），實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

電子控制性腦皮質(zhì)撞擊儀（eCCI，美國Custom &Design公司），Nano Drop 2000（美國Thermo Fisher Scientific公司），real-time PCR儀（Step One Plus，美國ABI公司）。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組及TBI模型的復(fù)制將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)等分為7組，即輕度TBI組（L組）、輕度TBI加井穴放血組（L+B組）、中度TBI組（M組）、中度TBI加井穴放血組（M+B組）、重度TBI組（H組）、重度TBI加井穴放血組（H+B組）和對(duì)照組，每組8只。各TBI組經(jīng)1%戊巴比妥鈉按40 mg/kg麻醉后，暴露右側(cè)頂骨，顱鉆鉆孔直徑約4.5 mm，調(diào)整eCCI打擊臂至與垂直方向呈20°夾角，使用3 mm直徑打擊帽打擊大腦皮質(zhì)。參數(shù)如下：打擊速率為5 m/s，打擊后最低點(diǎn)持續(xù)時(shí)間為0.2 s，輕度、中度、重度TBI組的打擊深度分別為1、3和4 mm[5]。對(duì)照組僅開骨窗后縫合皮膚，不進(jìn)行打擊。

1.3.2 十二井穴放血用1 ml注射器針頭于大鼠雙側(cè)前肢趾端的十二井穴點(diǎn)刺出血，出血量為每穴10 μl，每12 h進(jìn)行1次放血，穴位定位方法采用比較解剖學(xué)，參考人體相應(yīng)穴位解剖標(biāo)志。

1.3.3 神經(jīng)功能損傷評(píng)分及標(biāo)本采集7組大鼠均于術(shù)后第72 h行mNSS評(píng)分[6]，分?jǐn)?shù)越高說明癥狀越嚴(yán)重，最嚴(yán)重為18分，0分為正常。評(píng)價(jià)完成后采用頸椎離斷法處死大鼠，各組均取損傷灶周邊同一部位腦皮質(zhì)約10 mg，進(jìn)行后續(xù)DNA和RNA的提取，剩余腦組織進(jìn)行干濕比重測(cè)量。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative realtime polymerase chain reaction，qRT-PCR）測(cè)定相關(guān)基因表達(dá)及線粒體DNA拷貝數(shù)按照說明書，提取腦組織的基因組DNA和總RNA，并將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。qRT-PCR測(cè)定線粒體生物合成相關(guān)基因的表達(dá)變化，包括過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptorgamma coactivator-1alpha，PGC-1α）、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM），以及可代表mtDNA拷貝數(shù)的線粒體單拷貝基因環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase 2，COX2）。方法如下：配制PCR反應(yīng)體系，包括2×Ultra SYBR Mixture，cDNA 10 ng或基因組DNA 50 ng，以及相應(yīng)體積的引物和滅菌雙蒸水，每個(gè)基因設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。反應(yīng)條件采用兩步法：95℃10 min預(yù)變性，隨后95℃變性15 s，60℃退火延伸60 s，共40個(gè)循環(huán)測(cè)定Ct值，以0.3℃梯度逐步升溫行熔解曲線分析。應(yīng)用2-ΔΔCt法計(jì)算各目的基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

1.3.5 腦組織含水量測(cè)定取腦后僅保留左右大腦半球，立即稱重，所得質(zhì)量為濕重。隨后將大腦放入烘箱中，75℃烘烤48 h，稱重后所得質(zhì)量為干重。含水量=（濕重-干重）/濕重。

表1 設(shè)計(jì)引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能損傷評(píng)分

TBI后大鼠的mNSS評(píng)分均高于對(duì)照組，且隨著TBI嚴(yán)重程度的增加，評(píng)分依次增高（P＜0.05），且輕、中度TBI組大鼠在應(yīng)用井穴放血療法后mNSS評(píng)分與相應(yīng)的L和M組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 不同組別各指標(biāo)比較 （n =8，±s）

表2 不同組別各指標(biāo)比較 （n =8，±s）

組別 mNSS評(píng)分/分 PGC-1α TFAM mtDNA拷貝數(shù) 腦組織含水量L 組 5.75±1.751） 2.56±0.711） 2.40±0.971） 5.50±1.421） 0.788±0.0161）L+B 組 4.00±1.191）2） 3.13±0.871） 3.07±0.721） 7.82±3.201）2） 0.776±0.0121）M組 8.88±1.731） 2.49±0.781） 2.76±1.351） 5.03±3.361） 0.791±0.0091）M+B 組 6.63±2.131）2） 3.74±1.011）2） 3.41±1.481） 7.42±2.901）2） 0.780±0.0071）2）H組 10.63±2.071） 4.61±2.041） 3.64±0.711） 3.67±1.821） 0.797±0.0121）H+B 組 10.00±1.201） 5.47±1.951） 4.48±2.321） 4.00±1.831） 0.799±0.0151）

續(xù)表2

2.2 各基因表達(dá)及mtDNA拷貝數(shù)變化

TBI模型大鼠的PGC-1α和TFAM基因表達(dá)水平以及mtDNA拷貝數(shù)均高于對(duì)照組（P＜0.001）；輕度TBI組大鼠在應(yīng)用井穴放血療法后，mtDNA拷貝數(shù)高于相應(yīng)的未應(yīng)用放血療法的大鼠（P＜0.05），中度TBI組大鼠在應(yīng)用放血療法后PGC-1α基因表達(dá)水平和mtDNA拷貝數(shù)升高（P＜0.05），輕、重度TBI組大鼠在應(yīng)用井穴放血療法后，雖然PGC-1α和TFAM基因表達(dá)水平均有升高趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

2.3 腦組織含水量

TBI后各組大鼠腦組織含水量與對(duì)照組比較均增加，且中度TBI組大鼠在應(yīng)用井穴放血療法后腦組織含水量與相應(yīng)的M組比較降低（P＜0.05），見表2。

3 討論

腦水腫TBI后常見的并發(fā)癥之一，常于發(fā)病后第2天達(dá)到高峰，主要由創(chuàng)傷造成的腦組織缺血、缺氧以及Na+-K+離子泵的功能障礙導(dǎo)致細(xì)胞水腫引起，其可造成顱內(nèi)壓急劇增高，從而進(jìn)一步使腦的血液灌注減少，病情加重，甚至導(dǎo)致腦疝威脅生命[7]。井穴位于人體的四肢末端，是十二經(jīng)脈氣血起始之處，《醫(yī)宗金鑒-刺灸心法要訣》中指出：“商陽主刺卒中風(fēng)，暴仆昏沉痰涎壅，少商、中沖、關(guān)沖、少澤、商陽，使氣血流行，乃起死回生救急之妙穴”。放血療法最早的記載可見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，如“刺絡(luò)者，刺小絡(luò)之血脈也”；“菀陳則除之，出惡血也”，并明確地提出刺絡(luò)放血可以治療癲狂、頭痛、暴喑、熱喘及衄血等病證，與單純灸法比較，起除淤效果更佳。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，井穴放血可有效減輕輕度和中度TBI大鼠神經(jīng)功能損傷癥狀，并降低TBI后腦水腫的嚴(yán)重程度，提示TBI后應(yīng)用井穴放血療法可發(fā)揮腦保護(hù)作用。與苗笑梅和張靜莎等的研究結(jié)果類似，苗笑梅等[8]發(fā)現(xiàn)，十二井穴刺絡(luò)放血可以降低神經(jīng)功能缺陷評(píng)分，減輕腦水腫，對(duì)創(chuàng)傷性大鼠腦組織有保護(hù)作用，張靜莎等[9]也發(fā)現(xiàn)，手十二井穴放血有改善重型顱腦創(chuàng)傷患者意識(shí)狀態(tài)的作用趨勢(shì)，但上述兩項(xiàng)研究均未深入探討相關(guān)機(jī)制。細(xì)胞內(nèi)線粒體可通過氧化磷酸化為細(xì)胞活動(dòng)提供能量，當(dāng)創(chuàng)傷導(dǎo)致線粒體功能障礙時(shí)，可引起細(xì)胞內(nèi)乳酸堆積并影響Na+-H+交換，促進(jìn)腦水腫的發(fā)生[10]。為此本課題組進(jìn)而檢測(cè)腦組織中線粒體生物合成相關(guān)基因表達(dá)及mtDNA拷貝數(shù)的變化，以期探索井穴放血療法發(fā)揮腦保護(hù)作用的靶點(diǎn)。

結(jié)果表明，TBI后組織中mtDNA拷貝數(shù)增加，提示創(chuàng)傷在造成線粒體損傷后，mtDNA發(fā)生代償性擴(kuò)增。一方面，mtDNA是獨(dú)立存在于細(xì)胞器中的環(huán)狀基因組DNA，其在基因組之中的個(gè)數(shù)稱為mtDNA拷貝數(shù)，由于線粒體DNA缺少組蛋白的保護(hù)，使其容易受到氧化應(yīng)激、炎癥等危險(xiǎn)因素的損害，造成及線粒體功能障礙[11-12]，TBI后，損傷本身及壞死的腦組織可誘導(dǎo)活性氧族（ROS）及炎癥因子的釋放增多[13]，使機(jī)體進(jìn)入氧化應(yīng)激狀態(tài)從而造成mtDNA損傷。另一方面，ROS在造成DNA損傷的同時(shí)，本身亦可以作為第二信使，觸發(fā)TFAM和NRF的表達(dá)，促進(jìn)線粒體擴(kuò)增，從而降低功能障礙mtDNA所占比例，代償能量供應(yīng)水平的下降[14-15]。當(dāng)應(yīng)用井穴放血后，可見大鼠的PGC-1α基因以及下游的TFAM基因表達(dá)進(jìn)一步升高，且mtDNA拷貝數(shù)提高，表明井穴放血可能是通過激活PGC及下游通路，促進(jìn)mtDNA的生物合成，從而增強(qiáng)創(chuàng)傷腦組織的能量供應(yīng)，改善腦水腫程度，發(fā)揮腦保護(hù)作用。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，對(duì)于重度TBI大鼠，單獨(dú)應(yīng)用井穴放血療法時(shí)，雖然可一定程度上促進(jìn)mtDNA拷貝數(shù)的增加，但并未改善神經(jīng)功能損傷癥狀及腦水腫程度，這可能是由于重型TBI因損傷嚴(yán)重，會(huì)同時(shí)累及多條通路，多因素綜合作用導(dǎo)致腦水腫的發(fā)生，而單獨(dú)應(yīng)用井穴放血療法尚不足以展現(xiàn)改善腦水腫的作用，提示在重型TBI時(shí)應(yīng)多種治療策略共同施治，輔以井穴放血療法，或許能展現(xiàn)出更好的治療效果。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建TBI大鼠模型，初步探討井穴放血對(duì)腦水腫及線粒體生物合成基因的影響，為解釋井穴放血發(fā)揮腦保護(hù)作用的機(jī)制提供基礎(chǔ)研究。但TBI的發(fā)病是多因素共同造成，其發(fā)生發(fā)展也涉及其他多條通路及靶基因，這仍有待挖掘。若能進(jìn)一步探討井穴放血對(duì)其他通路的影響，或許可為TBI的臨床治療乃至開發(fā)井穴放血的新用途提供幫助。

[1] 江金文, 劉會(huì)云, 李美華. AQP4與創(chuàng)傷性腦水腫的研究進(jìn)展[J].國際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)雜志, 2017, 44(2): 213-217.

[2] 胡捷先, 陳獻(xiàn)華. 腦缺血后谷氨酸通路及其調(diào)控的研究進(jìn)展[J].復(fù)旦學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2016, 43(6): 724-731.

[3] 付浩, 楊小颯, 余東堃, 等. 凋亡抑制劑zVAD對(duì)腦缺血再灌注小鼠外周血線粒體DNA拷貝數(shù)的影響[J]. 遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2016, 39(6): 593-596.

[4] MALAKHOVA L, BEZLEPKIN V G, ANTIPOVA V, et al. The increase in mitochondrial DNA copy number in the tissues of gamma-irradiated mice[J]. Cell Mol Biol Lett, 2005, 10(4): 721-732.

[5] 付浩, 孫中磊, 楊小颯, 等. 腦皮質(zhì)撞擊法致創(chuàng)傷性腦損傷大鼠模型的構(gòu)建[J]. 遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2017, 40(1): 38-41.

[6] CHEN J, SANBERG P R, LI Y, et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats[J]. Stroke, 2001, 32(11): 2682-2688.

[7] 宋海燕, 王仙麗, 伊生勇. 惡性腦梗死伴腦水腫的研究進(jìn)展[J].武警后勤學(xué)院學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）, 2016, 25(7): 593-596.

[8] 苗笑梅, 程世翔, 楊震, 等. 十二井穴刺絡(luò)放血聯(lián)合亞低溫治療對(duì)顱腦創(chuàng)傷急性期大鼠腦水腫的影響[J]. 中國應(yīng)用生理學(xué)雜志,2015, 31(3): 249-253.

[9] 張靜莎, 郭義, 耿連岐. 手十二井穴刺絡(luò)放血、薏苡仁鼻飼聯(lián)合亞低溫對(duì)重型顱腦創(chuàng)傷影響的臨床療效評(píng)價(jià)的初步研究[J]. 世界中醫(yī)藥, 2016, 11(3): 510-514.

[10] 朱志安, 張紅, 高遠(yuǎn)征. 創(chuàng)傷性腦水腫腦組織乳酸及線粒體SOD、MDA水平的變化[J]. 中國臨床神經(jīng)外科雜志, 2000,5(2): 48-50.

[11] JOKINEN R, MARTTINEN P, STEWART J B, et al. Tissuespecific modulation of mitochondrial DNA segregation by a defect in mitochondrial division[J]. Hum Mol Genet, 2016, 25(4): 706-714.

[12] 向軍軍, 賴菁菁, 胡躍強(qiáng). 近3年線粒體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展[J]. 中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志, 2016, 14(13): 1497-1499.

[13] KAWABORI M, YENARI M A. Inflammatory responses in brain ischemia[J]. Curr Med Chem, 2015, 22(10): 1258-1277.

[14] LUNA B, BHATIA S, YOO C, et al. Bayesian network and mechanistic hierarchical structure modeling of increased likelihood of developing intractable childhood epilepsy from the combined effect of mtDNA variants, oxidative damage, and copy number[J]. J Mol Neurosci, 2014, 54(4): 752-766.

[15] 付浩, 胡文靜, 王志宏, 等. 腦缺血再灌注小鼠線粒體DNA拷貝數(shù)與神經(jīng)功能損傷相關(guān)性研究[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2017, 26(1): 4-6.