馬薇薇，蔣春艷，崔毓桂

(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，南京 210029)

細(xì)胞生物學(xué)中普遍存在Ca2+介導(dǎo)的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)模式，由細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度和空間分布的變化構(gòu)成。Ca2+參與調(diào)控機(jī)體幾乎所有的生物學(xué)功能，諸如心臟和肌肉收縮、神經(jīng)信息傳遞、胚胎形成和發(fā)育、細(xì)胞增殖和凋亡、細(xì)胞能量代謝等等。但長(zhǎng)期的細(xì)胞內(nèi)高Ca2+具有細(xì)胞毒性，可觸發(fā)細(xì)胞死亡。因此，波、尖峰或震蕩形式的鈣信號(hào)必須受到嚴(yán)密的調(diào)控。多種多樣的離子通道、離子泵以及轉(zhuǎn)運(yùn)體的協(xié)同工作，形成了細(xì)胞膜內(nèi)外和細(xì)胞器內(nèi)外陡峭又嚴(yán)格受控的Ca2+濃度梯度[1]。卵母細(xì)胞成熟是細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)化過(guò)程，受到Ca2+的嚴(yán)密調(diào)控。Ca2+促使卵母細(xì)胞從減數(shù)分裂阻滯期恢復(fù)，從而促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟。

一、細(xì)胞內(nèi)鈣的調(diào)節(jié)

細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度維持約100 nmol/L，這是胞內(nèi)鈣信號(hào)的背景基礎(chǔ)。胞外Ca2+濃度約為1～2 mmol/L，細(xì)胞內(nèi)Ca2+儲(chǔ)存庫(kù)(主要是內(nèi)質(zhì)網(wǎng))中的Ca2+濃度在250～600 μmol/L。鈣信號(hào)產(chǎn)生是由于細(xì)胞外Ca2+的內(nèi)流，或是細(xì)胞內(nèi)的Ca2+庫(kù)外流。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和質(zhì)膜上的通道和鈣泵相互協(xié)作，調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞質(zhì)中的鈣穩(wěn)態(tài)[1]。

1.細(xì)胞膜的鈣調(diào)節(jié)：細(xì)胞膜主要的Ca2+通道包括瞬時(shí)感受器電位通道(transient receptor potential，TRP)、電壓門控鈣通道(voltage-gated calcium channel，VGCC)和庫(kù)控鈣內(nèi)流(store-operated Ca2+entry，SOCE)。它們介導(dǎo)細(xì)胞外Ca2+流入細(xì)胞質(zhì)，而鈉鈣交換體(Na+/Ca2+exchange，NCX)、Ca2+-ATP酶等轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白則負(fù)責(zé)將Ca2+移出細(xì)胞[2]。

TRP通道在各器官分布廣泛，對(duì)Na+、K+和Ca2+都有通透性。對(duì)Ca2+的通透性會(huì)因亞型不同而有很大差異，按照基因同源性可以分為6個(gè)家族。TRP通道可被多種因素調(diào)節(jié)，如溫度、滲透壓、pH 值、機(jī)械力、配體等[3-4]。

VGCC對(duì)腦、骨骼肌、心肌、平滑肌、內(nèi)分泌腺以及其他可興奮細(xì)胞的生理功能至關(guān)重要。這些膜蛋白將細(xì)胞膜去極化信號(hào)轉(zhuǎn)換為快速、局部的胞質(zhì)鈣濃度變化，繼而觸發(fā)分泌、收縮、遷移和基因轉(zhuǎn)錄等關(guān)鍵生物學(xué)事件[3-4]。

當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的鈣儲(chǔ)量下降時(shí)，Ca2+可以從細(xì)胞外進(jìn)入細(xì)胞，這一過(guò)程稱為庫(kù)控鈣內(nèi)流。它的機(jī)制主要涉及細(xì)胞膜上的鈣釋放激活的鈣通道蛋白1(ORAI1)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的基質(zhì)相互作用分子1(STIM1)。機(jī)制在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣調(diào)節(jié)時(shí)詳述[3-4]。

細(xì)胞質(zhì)中低濃度的Ca2+主要由Ca2+-ATP酶維持。它們迅速地將胞內(nèi)Ca2+泵回到細(xì)胞器內(nèi)(如內(nèi)質(zhì)網(wǎng))，或泵出到細(xì)胞外空間。這些Ca2+-ATP酶根據(jù)其亞細(xì)胞定位，可進(jìn)一步分為三個(gè)亞型：質(zhì)膜Ca2+-ATP酶(PMCA)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶(SERCA)和高爾基體、高爾基體的囊泡分泌途徑Ca2+-ATP酶(SPCA)。每個(gè)亞型包含多個(gè)異構(gòu)體和剪接變異體，其表達(dá)、調(diào)節(jié)和動(dòng)力學(xué)特性皆呈現(xiàn)組織特異性。因此，Ca2+-ATP酶有助于形成一個(gè)高度復(fù)雜而精細(xì)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)網(wǎng)[1-2]。

2.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣的調(diào)節(jié)：細(xì)胞內(nèi)Ca2+高度集中在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，它不是簡(jiǎn)單的儲(chǔ)存場(chǎng)所，而是一個(gè)動(dòng)態(tài)的存儲(chǔ)場(chǎng)所，它通過(guò)釋放或吸收鈣來(lái)對(duì)電和化學(xué)刺激作出反應(yīng)，從而有利于快速的生理性鈣信號(hào)介導(dǎo)。而Ca2+耗竭既是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的原因，也是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的結(jié)果。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)主要通過(guò)雷尼丁受體(RyR)和1，4，5-三磷酸肌醇受體(IP3R)釋放Ca2+[5]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+耗竭時(shí)，由肌漿網(wǎng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP 酶(SERCA)和基質(zhì)相互作用分子1(STIM1)維持細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)[6-7]。

RyRs是位于肌漿網(wǎng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的Ca2+通道，主要在可興奮細(xì)胞中表達(dá)。在肌肉中，通過(guò)開啟肌漿網(wǎng)的RyRs，Ca2+才得以釋放。哺乳動(dòng)物有三種不同亞型的RyRs，但沒(méi)有一個(gè)是完全特異性的亞型。RyR1主要表達(dá)于骨骼肌，骨骼肌肌質(zhì)網(wǎng)上的RyR1與細(xì)胞膜二氫吡啶受體(DHPR)分子間相互作用，當(dāng)動(dòng)作電位引起細(xì)胞膜去極化，DHPR的構(gòu)象變化激活RyR1 產(chǎn)生電壓依賴性鈣釋放；RyR2主要表達(dá)在心肌，心肌細(xì)胞興奮前，首先通過(guò)L型Ca2+通道使細(xì)胞外少量的Ca2+內(nèi)流，內(nèi)流的Ca2+誘導(dǎo)肌漿網(wǎng)內(nèi)Ca2+通過(guò)RyR2釋放至胞漿中，此過(guò)程稱之為Ca2+誘導(dǎo)的鈣釋放；RyR3主要表達(dá)在大腦和橫膈，也是通過(guò)Ca2+誘導(dǎo)鈣釋放的方式激活[8-9]。

IP3R是一個(gè)專門的受體門控鈣通道，通過(guò)1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)和鈣調(diào)節(jié)Ca2+濃度。IP3Rs主要在非興奮性細(xì)胞如血管平滑肌和呼吸平滑肌中表達(dá)。當(dāng)IP3與IP3R 結(jié)合，使通道開放，將Ca2+釋放到細(xì)胞質(zhì)中，而這一過(guò)程進(jìn)一步激活I(lǐng)P3敏感的鈣庫(kù)釋放Ca2+。該反應(yīng)導(dǎo)致局部Ca2+增加，促進(jìn)鈣結(jié)合在IP3R第二位點(diǎn)，使IP3R通道失活，終止鈣的釋放。肌漿網(wǎng)中Ca2+減少也有助于終止Ca2+的釋放[3，8]。

STIM1是肌漿網(wǎng)的膜蛋白，作為Ca2+傳感器，向質(zhì)膜Ca2+通道傳遞信息。當(dāng)內(nèi)部存儲(chǔ)的Ca2+下降時(shí)，STIM1可形成點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)聚集在肌漿網(wǎng)上，并促使肌漿網(wǎng)靠近質(zhì)膜，與細(xì)胞膜上的鈣釋放激活的ORAI1相互作用，使得Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[3，7]。而SERCA作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/肌漿網(wǎng)主要的鈣泵，每水解1分子ATP，將從胞漿運(yùn)輸兩個(gè)Ca2+到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，因此通過(guò)ORAI1進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的Ca2+，被SERCA回收到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。鑒于SERCA泵對(duì)鈣代謝的重要性，它們的活動(dòng)受多層次的嚴(yán)格管制，包括基因轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)、與內(nèi)源性蛋白的相互作用，以及各種翻譯后修飾[8]。

3.線粒體的鈣調(diào)節(jié)：線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間有緊密的物理聯(lián)系，稱作線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)偶聯(lián)。它的主要功能是調(diào)控脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和控制細(xì)胞鈣信號(hào)。為了攝取鈣，線粒體必須暴露于高鈣濃度，此過(guò)程最有可能發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)附近。在接觸部位，Ca2+直接從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移到線粒體，控制關(guān)鍵的線粒體功能，如凋亡和生物合成。此外，線粒體對(duì)Ca2+的攝取也參與了鈣信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，并可防止細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+的過(guò)度升高[10-11]。

線粒體是細(xì)胞內(nèi)的鈣緩沖區(qū)，緩沖質(zhì)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Ca2+流，從而維持鈣穩(wěn)態(tài)。干擾這種鈣緩沖活動(dòng)將導(dǎo)致胞內(nèi)鈣異常增加，可激活不同的信號(hào)通路，包括鈣和鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性的蛋白激酶Ⅱ型(CaMKⅡ)，導(dǎo)致卵母細(xì)胞周期改變。細(xì)胞質(zhì)的Ca2+可以通過(guò)線粒體外膜電壓依賴的陰離子選擇性通道(voltage dependent anion-selective channel，VDAC)，先通過(guò)線粒體外膜，再通過(guò)線粒體內(nèi)膜依賴單向吸收體(mitochondrial calcium uniporter，MCU)將Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體內(nèi)部。而線粒體內(nèi)累積的Ca2+最終將通過(guò)鈉鈣交換體和氫/鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白移除[9，12]。

VDAC蛋白是線粒體外膜通道中最豐富的蛋白。它們調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)外呼吸代謝物的運(yùn)輸，并且廣泛參與調(diào)節(jié)代謝物和活性氧自由基(ROS)水平以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體之間的信號(hào)傳導(dǎo)。在哺乳動(dòng)物中，VDAC有三種同種型，由位于不同染色體上的不同基因編碼。進(jìn)化最早的同種型是VDAC3，而VDAC1是最主要的。所有的同種型都在哺乳動(dòng)物線粒體中普遍表達(dá)，但在物種間有差異，而個(gè)體的表達(dá)水平在不同組織之間也有變化。細(xì)胞VDAC位于外線粒體膜中，所有三種同種型都與線粒體結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(mitochondria-associated ER-membrane，MAM)密切相關(guān)。許多蛋白質(zhì)組學(xué)研究的發(fā)現(xiàn)表明，所有的同種型都可能參與線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)偶聯(lián)。VDAC2在HL-1細(xì)胞的肌漿網(wǎng)/線粒體結(jié)上與RyR2物理相互作用，以產(chǎn)生對(duì)線粒體Ca2+攝取至關(guān)重要的Ca2+微域[9，12]。

MCU的主要成分仍然未知。作為線粒體內(nèi)膜攝入Ca2+的唯一來(lái)源，MCU對(duì)Ca2+具有低親和力。這一特性可以解釋為線粒體通常緊鄰內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/肌漿網(wǎng)膜中IP3R或RyR Ca2+的出口處，能夠感測(cè)具有高Ca2+濃度的微區(qū)域，因而補(bǔ)償了MCU的低親和力。這種機(jī)制可以控制線粒體膜上的Ca2+運(yùn)輸，并阻止線粒體Ca2+過(guò)載[12]。

4.細(xì)胞內(nèi)鈣結(jié)合蛋白：Ca2+可以直接傳遞信息，也可以結(jié)合酶位點(diǎn)，并升高或者降低酶的活性。但是，在大多數(shù)情況下，Ca2+并不直接傳遞信息。Ca2+信號(hào)不同的振幅、頻率和位置可編碼多種信息，這些信息可以由鈣結(jié)合蛋白破譯。鈣結(jié)合蛋白是能夠與Ca2+特異性結(jié)合的一類蛋白質(zhì)的總稱，具有EF-手的結(jié)構(gòu)特征。EF-手結(jié)構(gòu)是Ca2+結(jié)合區(qū)，每個(gè)EF-手有兩個(gè)Ca2+結(jié)構(gòu)域，可以各結(jié)合一個(gè)Ca2+。迄今為止發(fā)現(xiàn)了超過(guò)800種鈣結(jié)合蛋白，其中，有100多種蛋白的三維立體結(jié)構(gòu)被揭示。然而，它們精確的功能依然未知。重要的鈣結(jié)合蛋白都是EF-手結(jié)構(gòu)蛋白，如鈣調(diào)蛋白(Calmodulin)、肌鈣蛋白C(troponin C)、恢復(fù)蛋白(recoverin)、S-100、STIM(基質(zhì)相互作用分子)，它們都結(jié)合Ca2+并傳遞信號(hào)。其他EF-手結(jié)構(gòu)蛋白，例如小清蛋白、鈣視網(wǎng)膜蛋白可以維持Ca2+的動(dòng)態(tài)平衡。這些蛋白質(zhì)大多含有偶數(shù)個(gè)的(在2～12之間)EF-手結(jié)構(gòu)[13]。

在進(jìn)化中，鈣調(diào)蛋白(CaM)是最為保守的EF-手結(jié)構(gòu)蛋白。它廣泛存在于所有真核生物中，且在所有脊椎動(dòng)物中的編碼序列是100%相同的。在人類中，它由三個(gè)非等位基因編碼，但盡管蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相同，編碼序列卻差異很大。CaM的外形類似啞鈴，有2個(gè)相似的球形末端，中間是長(zhǎng)的靈活的螺旋結(jié)構(gòu)，且EF-手結(jié)構(gòu)易于成對(duì)出現(xiàn)。當(dāng)CaM與Ca2+結(jié)合后，CaM出現(xiàn)構(gòu)象的改變，暴露蛋白表面的疏水區(qū)，與靶蛋白親和性增強(qiáng)，能迅速與靶蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞功能[13-14]。

STIM是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的蛋白質(zhì)，能探測(cè)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的Ca2+的濃度。STIM的EF-手結(jié)構(gòu)是不尋常的，它由典型的和非典型的EF-手結(jié)構(gòu)組成。EF-手結(jié)構(gòu)可結(jié)合Ca2+，但非典型EF-手結(jié)構(gòu)中對(duì)Ca2+至關(guān)重要的氨基酸被替換，影響了與鈣的結(jié)合，因此在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Ca2+呈現(xiàn)高濃度時(shí)，STIM與Ca2+的親和力比CaM和其他EF-手結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)低3個(gè)數(shù)量級(jí)。當(dāng)鈣庫(kù)消耗后，Ca2+又從STIM分子的EF-手結(jié)構(gòu)域中解離，STIM的構(gòu)象改變，與細(xì)胞膜上的ORAl1蛋白結(jié)合，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與細(xì)胞膜之間形成連接，激活鈣通道的開放[11]。

S-100蛋白家族是也是含EF-手的蛋白質(zhì)家族，因在飽和硫酸銨溶液中可溶而得名。到現(xiàn)在，在人類已經(jīng)確定21種S-100蛋白。他們很小，通常包含兩個(gè)EF-手，在C-末端是典型的EF-手結(jié)構(gòu)，而N-末端的是一個(gè)偽EF-手結(jié)構(gòu)，其中14號(hào)殘基與Ca2+結(jié)合的親和力很低。這些蛋白質(zhì)也結(jié)合其他的二價(jià)金屬離子如鋅和銅，并且通常是以同源二聚體形式出現(xiàn)。它們調(diào)節(jié)許多細(xì)胞功能，如轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期、細(xì)胞生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)、分化。除了金屬離子，其中一些也與目標(biāo)蛋白例如細(xì)胞外的RAGE(晚期糖基化終產(chǎn)物受體)結(jié)合。目前尚不清楚它們是主動(dòng)分泌還是被動(dòng)釋放到細(xì)胞外。一些S-100蛋白表達(dá)的失調(diào)會(huì)導(dǎo)致不同的疾病表型，包括癌癥[15]。

二、Ca2+的細(xì)胞生物學(xué)作用

“第一信使”與質(zhì)膜受體的相互作用，是傳遞信息給細(xì)胞的典型方式，而隨之激活擴(kuò)散的“第二信使”，又將信息傳達(dá)到目標(biāo)細(xì)胞。Ca2+就是可擴(kuò)散的第二信使之一。然而，Ca2+也可以作為第一信使直接進(jìn)入細(xì)胞，將信號(hào)攜帶到細(xì)胞靶點(diǎn)，與質(zhì)膜受體的相互作用。而在更多的細(xì)胞中，Ca2+則會(huì)作為第一信使，與典型的質(zhì)膜受體結(jié)合，觸發(fā)第二信使IP3的形成。Ca2+被第二信使IP3釋放到胞質(zhì)中，稱之為“第三信使”更為正確[16]。

已知Ca2+是體內(nèi)重要的信號(hào)分子，調(diào)控許多信號(hào)通路。在線粒體中，Ca2+的主要任務(wù)是調(diào)節(jié)ATP的產(chǎn)生。Ca2+依賴性磷酸酶激活丙酮酸脫氫酶、α-酮戊二酸脫氫酶和異檸檬酸脫氫酶，加速三羧酸循環(huán)，生成煙酰胺腺嘌呤核苷酸(NADH)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FADH2)，這些電子載體為電子傳輸鏈提供動(dòng)力，最終產(chǎn)生ATP[17]。

線粒體內(nèi)鈣超載，尤其是伴隨著氧化應(yīng)激時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致線粒體損傷，最終造成細(xì)胞死亡。這種鈣超載引起的細(xì)胞病理的發(fā)生是由于線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)的持續(xù)開放，mPTP是線粒體內(nèi)膜一種非特異性孔隙，可通過(guò)分子量高達(dá)1.5 kDa的分子。mPTP持續(xù)開放使得線粒體內(nèi)膜Ca2+內(nèi)流的驅(qū)動(dòng)力消散，減少氧化磷酸化和ATP的合成。此外，高膠體滲透壓還會(huì)導(dǎo)致線粒體基質(zhì)腫脹、嵴斷裂展開、內(nèi)膜斷裂，接著通過(guò)凋亡或壞死引起細(xì)胞死亡[17-18]。

鈣信號(hào)傳導(dǎo)在哺乳動(dòng)物的整個(gè)細(xì)胞周期中都起著關(guān)鍵作用。在G1期、G1/S轉(zhuǎn)換和有絲分裂期間，細(xì)胞內(nèi)的鈣濃度在不斷變化。在G1早期，鈣對(duì)于FOS、JUN和MYC等基因的表達(dá)以及后來(lái)的RB磷酸化反應(yīng)都很重要。而加入鈣調(diào)素拮抗劑在G1中觸發(fā)細(xì)胞周期停滯。鈣調(diào)蛋白的下游靶標(biāo)鈣調(diào)蛋白激酶(CaMK)和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶是細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)所必需的。鈣/鈣調(diào)蛋白通路還可調(diào)節(jié)幾種轉(zhuǎn)錄因子，如NFAT(活化T細(xì)胞核因子)或cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)，靶向控制細(xì)胞周期從G1進(jìn)展到S，其中CREB可通過(guò)鈣通路被CaMKⅡ和CaMKⅣ誘導(dǎo)磷酸化。磷酸化的CREB與目標(biāo)基因如細(xì)胞周期蛋白 D1啟動(dòng)子上的cAMP應(yīng)答元件(CRE)結(jié)合，從而激活轉(zhuǎn)錄[19]。

三、卵細(xì)胞中的鈣作用

Ca2+在哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞生理調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。在卵母細(xì)胞的成熟過(guò)程中，細(xì)胞周期會(huì)經(jīng)歷雙線期、MⅠ期和MⅡ期阻滯[20]，而鈣震蕩則使卵母細(xì)胞重新進(jìn)入減數(shù)分裂周期。卵母細(xì)胞的胞外介質(zhì)和/或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被觸發(fā)從而釋放Ca2+，激活CaMKⅡ，誘導(dǎo)ROS生成。CaMKⅡ激活、生理范圍內(nèi)活性氧ROS水平的升高和cAMP水平的降低直接或間接觸發(fā)成熟促進(jìn)因子(maturation promoting factor，MPF)失衡。不穩(wěn)定的MPF最后誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞減數(shù)分裂從雙線期、MⅠ期和MⅡ期的阻滯中恢復(fù)[21]。

在卵母細(xì)胞受精的過(guò)程中，需要Ca2+震蕩信號(hào)維持正常受精完成、啟動(dòng)胚胎發(fā)育信號(hào)并維持正常的胚胎發(fā)育。Ca2+被釋放到卵母細(xì)胞內(nèi)的確切機(jī)制尚未闡明，如今，精子因子假說(shuō)已得到普遍接受。精子因子(sperm factor，SF)，如磷脂酶C(PLCζ)或后頂體鞘WW結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白(post-acrosomal sheath WW domainbinding protein，PAWP)，擴(kuò)散到胞質(zhì)啟動(dòng)分子級(jí)聯(lián)反應(yīng)，該反應(yīng)主要涉及肌醇磷脂途徑。受精時(shí)，PLCζ釋放到胞質(zhì)，水解磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(hydrolyzes phosphatidylinositol 4，5-biphosphate，PIP2)，生成IP3。IP3與IP3R結(jié)合，觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲(chǔ)存的鈣釋放。PAWP似乎可與卵母細(xì)胞性YAP蛋白(yes-associated protein)結(jié)合，最后激活磷酸肌醇信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。精子因子的作用導(dǎo)致周期性波樣短暫的鈣釋放，從而產(chǎn)生皮質(zhì)顆粒的胞吐作用，激活卵母細(xì)胞，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)使得卵母細(xì)胞受精，轉(zhuǎn)換成二倍體胚胎[22]。

在卵母細(xì)胞成熟和激活的過(guò)程中，Ca2+震蕩有著重要的作用，因此維持其在卵母細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)是至關(guān)重要的。其調(diào)控機(jī)制主要包括STIM1、ORAI1、SERCA和PMCAs。STIM1作為低鈣水平傳感器，發(fā)生改變或不足均可能導(dǎo)致卵母細(xì)胞的激活不足，它是精子激活的卵母細(xì)胞激活因子(SOAF)觸發(fā)生成Ca2+震蕩的關(guān)鍵。當(dāng)PIP2水解為IP3和DAG，IP3與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的IP3R結(jié)合，這將導(dǎo)致IP3R通道開放，使鈣流出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔。位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的STIM1感受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+濃度降低后，將使STIM1從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜重新定位到質(zhì)膜，與ORAI1通道直接相互作用。此通道隨后打開，并允許鈣進(jìn)入細(xì)胞。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+濃度正常時(shí)，STIM1與ORAI1分離，阻止Ca2+內(nèi)流。除了STIM1和ORAI1，SERCA和PMCAs也參與鈣平衡。SERCA位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，將胞漿Ca2+泵到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔。細(xì)胞外Ca2+通過(guò)ORAI1和其它膜通道蛋白進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后，被SERCA泵入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。這使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Ca2+得以補(bǔ)充，而后IP3再與其受體相互作用，從而產(chǎn)生另一個(gè)Ca2+震蕩。PMCAs是位于質(zhì)膜而不是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣泵，可將Ca2+從胞外空間泵送到細(xì)胞質(zhì)中。目前，尚不清楚SERCAs和PMCAs的改變是否有可能損害卵母細(xì)胞激活的能力。這些蛋白同時(shí)作用，使得卵母細(xì)胞的Ca2+維持穩(wěn)態(tài)，保證Ca2+信號(hào)的傳遞和卵母細(xì)胞的激活[23]。

四、IVM中Ca2+的作用

體外成熟(IVM)是指從對(duì)竇卵泡提取未成熟卵母細(xì)胞，并在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)成熟的方法。IVM可以減少激素類似物的使用，消除卵巢過(guò)度刺激綜合征(OHSS) 和可能的長(zhǎng)期并發(fā)癥，如激素依賴性腫瘤包括乳腺癌和卵巢癌等，具有一定的臨床優(yōu)勢(shì)[24]。然而，迄今為止，使用年輕女性的卵母細(xì)胞獲得的臨床妊娠率仍較低[25]。卵母細(xì)胞成熟是一個(gè)長(zhǎng)期的過(guò)程，包括細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)成熟。細(xì)胞核成熟主要涉及染色體分離，以出現(xiàn)兩個(gè)極體為成熟的標(biāo)志。細(xì)胞質(zhì)成熟主要涉及細(xì)胞器的重新分布以及mRNA、蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄因子的存儲(chǔ)，以備卵母細(xì)胞成熟、受精和早期胚胎發(fā)育之用[5]。細(xì)胞質(zhì)成熟十分復(fù)雜，目前仍然有許多研究存在爭(zhēng)議。IVM在誘導(dǎo)減數(shù)分裂核成熟方面簡(jiǎn)單方便，但在誘導(dǎo)適當(dāng)?shù)募?xì)胞質(zhì)和分子成熟方面則較為復(fù)雜，而這對(duì)卵母細(xì)胞成熟卻是必不可少的[26]。

在IVM取卵過(guò)程中，卵母細(xì)胞從卵泡環(huán)境中取出時(shí)，cAMP濃度急劇降低，卵母細(xì)胞減數(shù)分裂自發(fā)恢復(fù)，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)的不完全成熟。細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核成熟的不同步，將影響卵母細(xì)胞的發(fā)育和胚胎質(zhì)量。通過(guò)藥理學(xué)方法抑制減數(shù)分裂一直是許多研究者的努力，其中一些藥物靶向作用于cAMP通路，如cAMP調(diào)節(jié)劑雙丁酰環(huán)腺苷酸(dbcAMP)、磷酸二酯酶抑制劑西洛酰胺(cilostamide)、腺苷酸環(huán)化酶的刺激劑福司考林(forskolin)等。這些藥物的目的是為了保持高濃度的cAMP，防止體外卵母細(xì)胞核過(guò)早成熟，從而提供足夠的時(shí)間使得卵母細(xì)胞的核和胞漿成熟同步。但這些卵母細(xì)胞在處理之后，發(fā)育能力通常低于在沒(méi)有抑制的情況下培養(yǎng)的卵母細(xì)胞[27]。而另一種方法則是調(diào)節(jié)鈣的信號(hào)通路。在真核生物中，MPF是最重要的調(diào)節(jié)減數(shù)分裂細(xì)胞周期進(jìn)程的因子，而Ca2+是卵母細(xì)胞中重要的信息傳遞分子，細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平增加，將通過(guò)CaMKⅡ激活MPF，使細(xì)胞核減數(shù)分裂繼續(xù)進(jìn)行。使用藥物誘導(dǎo)Ca2+從內(nèi)部存儲(chǔ)釋放，也可引發(fā)體外培養(yǎng)的小鼠、大鼠、牛、豬和人類卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的自發(fā)恢復(fù)。而早在 1992年，科學(xué)家們就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用BAPTA螯合Ca2+，可以阻止小鼠卵母細(xì)胞過(guò)早活化的跡象[28]。使用Ca2+通道阻斷劑(維拉帕米和硝苯地平)也能抑制體外培養(yǎng)的小鼠、大鼠、豬和牛卵母細(xì)胞減數(shù)分裂自發(fā)恢復(fù)。因此在IVM培養(yǎng)基中添加Ca2+抑制因子，通過(guò)阻斷細(xì)胞內(nèi)Ca2+的水平增加從而阻斷MPF的激活，也可以防止卵母細(xì)胞核的早熟。

由此可見，對(duì)于IVM卵母細(xì)胞核與胞漿成熟不同步的問(wèn)題，使用Ca2+通道阻斷劑是一種很有潛力的解決方案?，F(xiàn)在常規(guī)使用的IVM培養(yǎng)基都是基礎(chǔ)培養(yǎng)基，如TCM-199 medium、Ham’s-F10 medium和Chang’s medium，用碳酸氫鹽和/或HEPES緩沖，并輔以各種血清促性腺激素(FSH、LH)、生長(zhǎng)因子和激素，并沒(méi)有重視培養(yǎng)基Ca2+水平及其對(duì)于卵母細(xì)胞的重要作用[29]。目前發(fā)現(xiàn)在囊胚培養(yǎng)基中添加乳酸鈣，似乎對(duì)線粒體的功能有積極的作用[30]。但I(xiàn)VM培養(yǎng)基內(nèi)是否要添加、它的濃度是多少，現(xiàn)在尚未可知。同時(shí)IVM過(guò)程中，細(xì)胞在具有5%二氧化碳(CO2)和約20%大氣氧氣(O2)濃度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，但是動(dòng)物體內(nèi)的氧分壓遠(yuǎn)低于大氣氧分壓。細(xì)胞暴露于高氧水平能夠增加ROS的產(chǎn)生，可以引起細(xì)胞損傷，降低卵母細(xì)胞及其胚胎的發(fā)育潛能。同時(shí)ROS還會(huì)調(diào)節(jié)細(xì)胞膜和細(xì)胞器的鈣離子通道，改變細(xì)胞內(nèi)的鈣分布，從而激活細(xì)胞核的成熟[31]?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的抗氧化劑，如槲皮素、維生素C和白藜蘆醇等，均可降低體外成熟卵母細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)ROS水平，提高胚胎數(shù)量和質(zhì)量[32]。

五、總結(jié)和展望

Ca2+信號(hào)的傳導(dǎo)影響細(xì)胞生命和死亡的各個(gè)方面。在所有生物體內(nèi)，Ca2+是受到最嚴(yán)密調(diào)控的離子，細(xì)胞膜和細(xì)胞器上存在多種通道的調(diào)節(jié)，嚴(yán)格調(diào)控胞內(nèi)和細(xì)胞器中的Ca2+水平。Ca2+結(jié)合成千上萬(wàn)的蛋白質(zhì)，以影響它們的定位及功能。在卵母細(xì)胞成熟中，必須強(qiáng)調(diào)鈣信號(hào)的發(fā)生以及對(duì)卵母細(xì)胞的影響，以闡明鈣震蕩在卵母細(xì)胞成熟和發(fā)育中中的必要作用。對(duì)卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中鈣調(diào)節(jié)的研究，有助于了解卵母細(xì)胞及胚胎的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。卵母細(xì)胞成熟異常所導(dǎo)致的受精異常和不受精是IVM成功率低的重要原因之一。目前，為改善IVM中卵母細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)成熟不同步的問(wèn)題，研究大多集中在阻止cAMP急劇降低，但成功率并沒(méi)有顯著提升。而1992年科學(xué)家就發(fā)現(xiàn)Ca2+螯合劑能阻止減數(shù)分裂自發(fā)恢復(fù)，防止卵母細(xì)胞核過(guò)早成熟，從而為細(xì)胞質(zhì)成熟提供時(shí)間。所以，研究Ca2+在卵母細(xì)胞成熟的作用機(jī)制，對(duì)理解人類卵細(xì)胞的發(fā)育機(jī)制至關(guān)重要，該研究的結(jié)果將為IVM及體外受精-胚胎移植(IVF-ET)等提供新的理論依據(jù)，從而改善卵子質(zhì)量，提高IVM的成功率。

[1] Machaca K.Ca(2+) signaling，genes and the cell cycle[J].Cell Calcium，2010，48：243-250.

[2] Cui C，Merritt R，F(xiàn)u L，et al.Targeting calcium signaling in cancer therapy[J].Acta Pharm Sin B，2017，7：3-17.

[3] Perez-Zoghbi JF，Karner C，Ito S，et al.Ion channel regulation of intracellular calcium and airway smooth muscle function[J].Pulm Pharmacol Ther，2009，22：388-397.

[4] Cai X，Wang X，Patel S，et al.Insights into the early evolution of animal calcium signaling machinery：a unicellular point of view[J].Cell Calcium，2015，57：166-173.

[5] Mao L，Lou H，Lou Y，et al.Behaviour of cytoplasmic organelles and cytoskeleton during oocyte maturation[J/OL].Reprod Biomed Online，2014，28：284-299.

[6] Paredes RM，Bollo M，Holstein D，et al.Luminal Ca2+depletion during the unfolded protein response in Xenopus oocytes：cause and consequence[J].Cell Calcium，2013，53：286-296.

[7] Rossi AE，Boncompagni S，Dirksen RT.Sarcoplasmic reticulum-mitochondrial symbiosis：bidirectional signaling in skeletal muscle[J].Exerc Sport Sci Rev，2009，37：29-35.

[8] Chernorudskiy AL，Zito E.Regulation of calcium homeostasis by ER redox：a close-up of the ER/Mitochondria connection[J].J Mol Biol，2017，429：620-632.

[9] Raffaello A，Mammucari C，Gherardi G，et al.Calcium at the center of cell signaling：interplay between endoplasmic reticulum，mitochondria，and lysosomes[J].Trends Biochem Sci，2016，41：1035-1049.

[10] Lopez-Crisosto C，Pennanen C，Vasquez-Trincado C，et al.Sarcoplasmic reticulum-mitochondria communication in cardiovascular pathophysiology[J].Nat Rev Cardiol，2017，14：342-360.

[11] Moccia F，Zuccolo E，Soda T，et al.Stim and Orai proteins in neuronal Ca(2+) signaling and excitability[J].Front Cell Neurosci，2015，9：153.

[12] Prasai K.Regulation of mitochondrial structure and function by protein import：A current review[J].Pathophysiology，2017，24：107-122.

[13] Carafoli E，Krebs J.Why calcium? How calcium became the best communicator[J].J Biol Chem，2016，291：20849-20857.

[14] Bagur R，Hajnóczky G.Intracellular Ca2+sensing：its role in calcium homeostasis and signaling[J].Mol Cell，2017，66：780-788.

[15] Lippi G，Aloe R，Numeroso F，et al.The significance of protein S-100B testing in cardiac arrest patients[J].Clin Biochem，2011，44：567-575.

[16] Clapham DE.Calcium signaling[J].Cell，2007，131：1047-1058.

[17] Vakifahmetoglu-Norberg H，Ouchida AT，Norberg E.The role of mitochondria in metabolism and cell death[J].Biochem Biophys Res Commun，2017，482：426-431.

[18] Rizzuto R，De Stefani D，Raffaello A，et al.Mitochondria as sensors and regulators of calcium signalling[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2012，13：566-578.

[19] Ziegler DV，Wiley CD，Velarde MC.Mitochondrial effectors of cellular senescence：beyond the free radical theory of aging[J].Aging Cell，2015，14：1-7.

[20] Tripathi A，Kumar KV，Chaube SK.Meiotic cell cycle arrest in mammalian oocytes[J].J Cell Physiol，2010，223：592-600.

[21] Tiwari M，Prasad S，Shrivastav TG，et al.Calcium signaling during meiotic cell cycle regulation and apoptosis in mammalian oocytes[J].J Cell Physiol，2017，232：976-981.

[22] Anifandis G，Messini CI，Dafopoulos K，et al.Sperm contributions to oocyte activation：more that meets the eye[J].J Assist Reprod Genet，2016，33：313-316.

[23] Yeste M，Jones C，Amdani SN，et al.Oocyte activation and fertilisation：crucial contributors from the sperm and oocyte[J].Results Probl Cell Differ，2017，59：213-239.

[24] Makki M，Saboori E，Sabbaghi MA，et al.Effects of selenium，calcium and calcium ionophore on human oocytes in vitro maturation in a chemically defined medium[J].Iran J Reprod Med，2012，10：343-348.

[25] Ellenbogen A，Shavit T，Shalom-Paz E.IVM results are comparable and may have advantages over standard IVF[J].Facts Views Vis Obgyn，2014，6：77-80.

[26] Sirard MA.Follicle environment and quality of in vitro matured oocytes[J].J Assist Reprod Genet，2011，28：483-488.

[27] Botigelli RC，Razza EM，Pioltine EM，et al.New approaches regarding the in vitro maturation of oocytes：manipulating cyclic nucleotides and their partners in crime[J].JBRA Assist Reprod，2017，21：35-44.

[28] Swann K，Yu Y.The dynamics of calcium oscillations that activate mammalian eggs[J].Int J Dev Biol，2008，52：585-594.

[29] Chian RC，Yang ZY.Development of in vitro maturation for human oocytes[M].Switzerland：Springer International Publishing AG，2017：337-350.

[30] Farsi MM，Kamali N，Pourghasem M.Embryological aspects of oocyte in vitro maturation[J].Int J Mol Cell Med，2013，2：99-109.

[31] Gorlach A，Bertram K，Hudecova S，et al.Calcium and ROS：A mutual interplay[J].Redox Biol，2015，6：260-271.

[32] Sovernigo TC，Adona PR，Monzani PS，et al.Effects of supplementation of medium with different antioxidants during in vitro maturation of bovine oocytes on subsequent embryo production[J].Reprod Domest Anim，2017，52：561-569.