張 娛, 劉智峰, 陳 明, 劉世軍, 許洪波, 唐志書*

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心, 陜西 咸陽 712083;2.湖南大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 長沙 410082

隨著生物化工業(yè)、精細(xì)化工業(yè)的不斷發(fā)展，微生物催化的各種反應(yīng)因具有產(chǎn)物純度高和對環(huán)境友好等優(yōu)勢而表現(xiàn)出越來越廣闊的應(yīng)用前景[1]。酰胺酶催化酰胺生成酸就屬于這一類，它催化各種酰胺生成相應(yīng)的酸，產(chǎn)物酸有比較活潑的羧基而更利于修飾或者合成其他更復(fù)雜的制藥或者化工中間體，但酰胺酶的催化底物范圍受限，對簡單的、無取代基的直鏈底物酶活較高，對芳香、雜環(huán)，尤其是存在鄰位取代基的酰胺催化效率很低，這是電子效應(yīng)與空間效應(yīng)共同作用的結(jié)果[2,3]。因此，通過篩選菌株或者對酶進行改造提高酰胺的降解效率成為亟待解決的難題。報道稱大多數(shù)研究主要集中在新菌種的篩選上，而對酶的改造很少關(guān)注，若能理解酰胺酶的性質(zhì)究竟對其底物的特異性起到了何種作用，就可以研究如何改變酶催化中心的構(gòu)型從而使酶活性中心的柔性增強，擴展酰胺酶的底物適用范圍[4,5]。

Kohyama等[6]用RhodococcuspyridinivoransS85-2產(chǎn)腈水合酶和BrevundimonasdiminutaAM 10-C-1產(chǎn)酰胺酶的級聯(lián)反應(yīng)將乙腈降解為乙酸，耐受的乙腈濃度達6 mol/L，10 h反應(yīng)后的轉(zhuǎn)化率高達90%。該工藝簡單高效，適用于含乙腈污染物的定點處理。Li等[7]用制藥廢水處理廠的活性污泥將乙腈作為唯一的碳源和氮源富集培養(yǎng)得到能降解乙腈、丙烯腈、苯甲腈的菌群，這在多種腈類的降解方面有良好的應(yīng)用前景。

酰胺酶催化水解的反應(yīng)機制和?；D(zhuǎn)移反應(yīng)相同，底物水的存在給反應(yīng)機制研究造成了困難。1986年，Macstracci等[8]用乙酰胺作底物，羥胺為共有底物，發(fā)現(xiàn)RhodococcusR312酰胺酶是雙底物乒乓反應(yīng)機制，并證實酰胺水解反應(yīng)也屬于這一機制，即酰胺先與酶結(jié)合生成?；?酶復(fù)合物，然后?；D(zhuǎn)給共底物水或者羥胺形成羧酸或者氧肟酸。羥胺和水并存時，共同爭奪?；?酶復(fù)合物，該復(fù)合物去?；统闪苏麄€反應(yīng)的限速步驟。因為羥胺比水更親核，所以?；D(zhuǎn)移反應(yīng)比水解反應(yīng)更快。迄今為止，還沒有從分子水平上(用分子對接技術(shù)等方法)對酰胺與酰胺酶之間的相互作用原理的報道。因此本研究通過軟件Molegro Virtual Docker(MVD)和LPC/CSU Server，用分子對接技術(shù)等方法研究酰胺與它們的降解酶之間的相互作用，以期揭示降解酶的微觀降解機制。

1 材料與方法

1.1 受體的準(zhǔn)備

本研究采用的晶體結(jié)構(gòu)取自PDB(ProteinData Bank)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(http://www.pdb.org/pdb)，PDB ID：3A1K(來自Rhodococcussp. N-771，簡稱為RhAmidase)。其3D結(jié)構(gòu)如圖1(彩圖見圖版六)所示。

圖1 Rhodococcus sp. N771酰胺酶的3D結(jié)構(gòu)Fig.1 Crystal structure of Amidase from Rhodococcus sp. N771. (彩圖見圖版六)

1.2 配體的準(zhǔn)備

用于分子對接計算的酰胺化合物取自數(shù)據(jù)庫ChemSpider，它建立的目的是將化學(xué)結(jié)構(gòu)式與其相關(guān)信息整合在一起并將其編入索引在一個單一并可供搜索的數(shù)據(jù)庫中，且所有的使用者都可以免費使用。所選底物的2D和3D結(jié)構(gòu)從ChemSpider(http://www.chemspider.com/)檢索，匯總在表1中。

1.3 分子對接方法

本研究采用MVD進行分子對接計算。MVD是跨平臺(Linux、Windows和Mac)的預(yù)測蛋白質(zhì)跟化學(xué)小分子結(jié)合的軟件，其對接精度高達87%[9]，可以提供準(zhǔn)確性較高的對接結(jié)果[10]。

表1 各種化合物的分子結(jié)構(gòu)和特征Table 1 Molecule structure and characteristic of compounds.

對接前去除酰胺酶的水分子、輔因子和結(jié)合的配合基。用MVD進行對接時，選擇MolDock Score[GRID]為打分函數(shù)，柵格分辨率為0.30?，搜索算法選擇MolDock SE，最大迭代次數(shù)為1 500，最大群體大小為50。MVD對接結(jié)果會提供很多可能的符合構(gòu)型，基于打分函數(shù)與二次打分函數(shù)最低原則篩選出最佳結(jié)合構(gòu)象。對接獲得的最佳結(jié)合構(gòu)象應(yīng)用LPC/CSU Server軟件進行進一步探討。LPC/CSU Server是研究配體與受體的相互作用情況的軟件，主要預(yù)測蛋白質(zhì)與配體之間的氫鍵作用、疏水作用以及親水-疏水作用等[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 RhAmidase與酰胺的分子對接結(jié)果

研究中選擇的酰胺酶來自Rhodococcussp. N-771 (簡寫為RhAmidase)。選擇的酰胺有2,2-dimethylcyclopropanecarboxamide、acetamide、acrylamide、benzamide、butyramide、formamide、hexamide、isobutyramide、L-alaninamide、L-leucinamide、L-methioninamide、L-prolinamid、L-threoninamide、methacrylamide、nicotinamide和propanamide(表1)。至今還沒有研究報道這些酰胺與RhAmidase之間的結(jié)合模式。這里首次用MVD通過分子對接研究它們之間的結(jié)合(圖2,彩圖見圖版六)。

圖2 RhAmidase和酰胺之間的結(jié)合模式Fig.2 Binding modes between RhAmidase and amides.注：RhAmidase的3D結(jié)構(gòu)用卡通體表示；酰胺的3D結(jié)構(gòu)用綠色條狀模型表示。A：RhAmidase 和 acetamide之間的結(jié)合模式；B：RhAmidase 和 formamide之間的結(jié)合模式；C：RhAmidase 和 nicotinamide之間的結(jié)合模式；D：RhAmidase 和 benzamide之間的結(jié)合模式；E：RhAmidase 和 propanamide之間的結(jié)合模式；F：RhAmidase 和 acrylamide之間的結(jié)合模式；G：RhAmidase 和 methacrylamide之間的結(jié)合模式；H：RhAmidase 和 butyramide之間的結(jié)合模式；I：RhAmidase 和 hexamide之間的結(jié)合模式；J：RhAmidase 和 isobutyramide之間的結(jié)合模式；K：RhAmidase 和 L-leucinamide之間的結(jié)合模式；L：RhAmidase和L-prolinamid之間的結(jié)合模式；M：RhAmidase 和L-methioninamide之間的結(jié)合模式；N：RhAmidase 和 L-threoninamide之間的結(jié)合模式；O：RhAmidase 和 L-alaninamide之間的結(jié)合模式；P：RhAmidase 和 2,2-dimethylcyclopropanecarboxamide之間的結(jié)合模式。 (彩圖見圖版六)

2.2 RhAmidase和酰胺最佳結(jié)合模式的篩選

在用MVD軟件進行分子對接的過程中，采用準(zhǔn)確性較高的打分算法MolDock對酰胺酶與選擇的底物酰胺的相互作用模式進行打分，從計算返回的10個優(yōu)勢構(gòu)象中通過比較RMSD、能量打分和基于經(jīng)驗判斷選擇最佳構(gòu)象，最終獲得底物酰胺與酰胺酶的最佳結(jié)合模式。最低的重排得分構(gòu)象作為首選結(jié)果。表2列出了MVD生成的最佳結(jié)合構(gòu)象的MolDock 得分和 Re-Rank 得分(表2)。有研究者觀察到RhAmidase 對丙烯酰胺有微弱的水解活性，一定程度上可能是由于RhAmidase 和丙烯酰胺之間的弱相互作用[12]。RhAmidase與L-methioninamide對接時二次打分函數(shù)為-76.022 4，較低的打分函數(shù)說明配體與蛋白質(zhì)匹配程度高，復(fù)合物穩(wěn)定性高。由MVD預(yù)測的最佳構(gòu)象經(jīng)LPC/CSU Server分析結(jié)果見圖3(彩圖見圖版七)和表3。由表3可知，RhAmidase與L-methioninamide之間的氫鍵作用有7種，疏水作用有13種，親水-疏水作用有10種，芳香-芳香作用有1種。說明RhAmidase與L-methioninamide之間以疏水作用數(shù)量最多。

表2 RhAmidase和酰胺之間分子對接構(gòu)象打分Table 2 Molecular docking pose scores between RhAmidase and amides.

2.3 RhAmidase和L-methioninamide之間的相互作用

高酰胺結(jié)合率可以延長酰胺酶活動的持續(xù)時間，從而增強反應(yīng)效果。本研究選取的酰胺酶屬于酰胺酶標(biāo)志(AS)家族，這個家族中Ser-cisSer-Lys 催化三聯(lián)體守恒[13]。 然而這3種氨基酸在結(jié)合L-methioninamide 時并不起重要作用(表3)。

2.4 RhAmidase/L-methioninamide復(fù)合物間的相互作用

酰胺酶來源不同，底物特異性也各異。一些酰胺酶只水解脂肪族酰胺，有些只水解芳香族酰胺，還有一些酰胺酶能水解氨基酰胺。大部分酰胺酶只對無環(huán)或簡單芳香類酰胺有催化能力，對復(fù)雜的芳香類或雜環(huán)類尤其是鄰位有取代基的酰胺活力不強。有研究者認(rèn)為這種現(xiàn)象是空間位阻和電子效應(yīng)共同作用的結(jié)果。

RhAmidase和L-methioninamide之間的氫鍵作用由殘基GLY219 A、TYR346 A、LEU353 A、ASN253 A、THR218 A、TYR217 A和ALA220 A形成。PRO255 A、ALA350 A、TYR346 A、LEU353 A、ARG225 A和PRO222 A與配體L-methioninamide形成疏水作用。疏水作用在RhAmidase和L-methioninamide之間大量存在，可能是產(chǎn)生RhAmidase/L-methioninamide復(fù)合體的主動力。6個殘基ARG256 A、LEU353 A、TYR346 A、ARG225 A、THR218 A和PRO222 A在RhAmidase以親水-疏水作用結(jié)合到L-methioninamide 時起重要作用。

表3 RhAmidase 和L-methioninamide之間的相互作用Table 3 Interactional profile of RhAmidase with L-methioninamide.

注：Hb:氫鍵; Ph:疏水作用; HH:親水-疏水作用; AA:芳香-芳香作用。

圖3 RhAmidase/L-methioninamide復(fù)合物間的 相互作用Fig.3 Interactions of RhAmidase/L-methioninamide complex.注：RhAmidase的3D結(jié)構(gòu)用黃色條狀模型表示； L-methioninamide的3D結(jié)構(gòu)用綠色條狀模型表示。相互作用用虛線顯示。 (彩圖見圖版七)

腈水合酶的立體選擇性較低，酰胺酶的立體選擇性較高。在生物細(xì)胞中，腈水合酶和酰胺酶的結(jié)構(gòu)基因處于同一個操縱子上，腈水合酶的合成時常伴隨著酰胺酶的存在，利用細(xì)胞中的腈水合酶和酰胺酶的級聯(lián)反應(yīng)可以實現(xiàn)良好的立體選擇性轉(zhuǎn)化，利用純的腈水合酶或者抑制細(xì)胞中酰胺酶活性可以實現(xiàn)酰胺的生產(chǎn)。在腈水合酶和酰胺酶的作用下，具光學(xué)性質(zhì)的腈不但能轉(zhuǎn)化成光活性的羧酸和酰胺，還能獲得很高的對映體過量值(ee)。

RhAmidase有3個結(jié)構(gòu)域、1個N端α螺旋結(jié)構(gòu)、1個小域和1個大域。N端α螺旋結(jié)構(gòu)域在其他的酰胺酶家族中不存在，這個區(qū)域與二聚物結(jié)構(gòu)形成有關(guān)，和小域一起形成1個窄的底物結(jié)合通道。大域與其他酰胺酶家族在結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)出高度的相似性。Ser-cisSer-Lys催化三聯(lián)體位于大域。但RhAmidase的底物結(jié)合口袋相對較窄，由于小結(jié)構(gòu)域中螺旋α13的存在。來自小域的疏水性殘基參與底物識別。小域可能參與了底物識別，它與底物特異性的家族酰胺酶之間的差異有關(guān)。

3 討論

酰胺類化合物在工業(yè)上用途廣泛，也是有機合成的重要中間體。微生物修復(fù)技術(shù)是解決這類環(huán)境問題的有效途徑之一。本研究分析了酰胺酶RhAmidase 與底物間的結(jié)合模式，并且成功確定了復(fù)合體RhAmidase/L-methioninamide的相互作用剖面圖。RhAmidase/底物復(fù)合體之間的相互作用有氫鍵、疏水作用、親水-疏水作用，出現(xiàn)在每種酰胺底物結(jié)合到相應(yīng)的酰胺酶時。RhAmidase和L-methioninamide 之間的氫鍵作用由殘基GLY219 A、TYR346 A、LEU353 A、ASN253 A、THR218 A、TYR217 A 和ALA220 A形成。PRO255 A、ALA350 A、TYR346 A、LEU353 A、ARG225 A 和PRO222 A 與配體L-methioninamide形成疏水作用。疏水作用在 RhAmidase和L-methioninamide之間大量存在，可能是產(chǎn)生RhAmidase/L-methioninamide復(fù)合體的主動力。6個殘基ARG256 A、LEU353 A、TYR346 A、ARG225 A、THR218 A和PRO222 A在RhAmidase以親水-疏水作用結(jié)合到L-methioninamide 時起重要作用。這些數(shù)據(jù)在今后設(shè)計對酰胺有更好的氧化活性的酰胺酶突變體時非常有用。

分子對接是計算機模擬分子間結(jié)合模式的一種重要方法，最初應(yīng)用于計算機輔助藥物設(shè)計。目前有研究者將其引入環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域，用于研究生物降解中酶和污染物的相互作用，揭示酶的作用機理。陳明等[14]將分子對接和分子模擬的方法引入了固體廢棄物堆肥研究中，探索了木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶這3種木質(zhì)素降解酶和木質(zhì)素小分子之間的結(jié)合模式；林玉珍等[15]用分子對接方法模擬了滴滴涕與漆酶、毒死蜱與有機磷水解酶的相互作用，發(fā)現(xiàn)滴滴涕與漆酶之間以疏水作用數(shù)量最多，毒死蜱與有機磷水解酶以氫鍵和疏水作用數(shù)量最多。這些研究為提高有機污染物的降解效率奠定了理論基礎(chǔ)。

在腈水合酶和酰胺酶的作用下，具有光學(xué)性質(zhì)的腈能轉(zhuǎn)化成光活性的羧酸和酰胺。α-芳基丙腈類衍生物水解產(chǎn)生的α-芳基丙酸具有光學(xué)活性，是擬除蟲菊酯和非甾體抗炎藥的重要中間體。Rhodococcussp. CGMCC 0497催化α-芳基丙腈水解成光活性的S-羧酸和R-酰胺，α-芳基丙腈上間位和對位取代的底物具有較好的對應(yīng)選擇性。王梅祥等[16]報道Rhodococcussp. AJ270產(chǎn)生的腈水合酶和酰胺酶能催化外消旋2-甲基-3-苯基環(huán)氧乙烷腈、2-芳基-4-戊烯腈類、α-氨基腈和α-甲基(α-乙基、α-異丙基)苯乙腈轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的光活性酰胺和羧酸，ee值高達99%。Christian等[17]發(fā)現(xiàn)Klebsiellaoxytoca38.1.2產(chǎn)生的腈水合酶能立體選擇性催化光學(xué)活性的2-苯基丙腈、2-苯基甘氨酸腈和苯乙醇腈生成對應(yīng)的S-型酰胺。此外，假單胞菌屬(Pseudomonas)、紅球菌屬(Rhodococcus)等多種菌所產(chǎn)腈水合酶和酰胺酶都表現(xiàn)出較高的立體選擇性[5]。

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