基于“筋脈橫解，腸澼為痔”理論研究兔直腸粘膜內(nèi)脫垂的發(fā)生機(jī)制

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1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003；2.福建省中醫(yī)藥研究院，福建 福州 350003；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建 福州 350004

直腸粘膜內(nèi)脫垂(Internal Rectal Prolapse,IRP)是出口型便秘的常見病因之一，發(fā)病率為外脫垂的3～10倍[1]。臨床表現(xiàn)為排便困難、排便不盡感、排便次數(shù)增多[2]和慢性肛門疼痛[3]等癥狀。臨床上采用注射療法[4]、STARR手術(shù)[5]等方法治療有效，但有專家認(rèn)為外科手術(shù)對(duì)改善IRP癥狀無(wú)效[6]。分析治療失敗的原因，主要與目前對(duì)IRP的本質(zhì)及病變過(guò)程未明確有關(guān)[7]。筆者旨在前期IRP動(dòng)物模型[8]的基礎(chǔ)上，研究IRP發(fā)生的階段性特征，探討IRP的發(fā)生機(jī)制，以期對(duì)臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 174只健康新西蘭兔，雌雄各半，1月齡，體重0.7～0.8kg，分別編號(hào)。由上海松聯(lián)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供[許可證號(hào)：scxk(滬)2012-0011]。兔由福建省中醫(yī)藥研究院比較醫(yī)學(xué)研究中心統(tǒng)一飼養(yǎng)，對(duì)兔的處置符合中《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》[9]中的規(guī)定。

1.2 藥物與儀器 生大黃液、番瀉葉液、無(wú)水酒精等由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院制劑室提供。 AGIC-20KN萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)，50倍讀數(shù)顯微鏡，UPER-SAP有限元軟件。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物造模 按照前期IRP兔的造模方案[8]，采用中藥生大黃液和番瀉葉液灌胃、站立與無(wú)水酒精肛周注射3種方法聯(lián)合造模，時(shí)間為2個(gè)月。

1.3.2 模型標(biāo)準(zhǔn) 按照前期IRP兔的模型標(biāo)準(zhǔn)[8]：①肛門鏡下見松弛的直腸黏膜遮擋肛鏡視野范圍在3/4上；②排便時(shí)兔直腸黏膜未脫出肛外；③直腸HE染色鏡下見：直腸粘膜層腺體增生，炎細(xì)胞浸潤(rùn)聚集，粘膜下層血管擴(kuò)張、間質(zhì)疏松水腫。

1.3.3 動(dòng)物分組

1.3.3.1 雄兔 將78只雄兔按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為4組：①正常組 6只兔，未造模時(shí)即解剖研究；②造模早期組(即造模第1天至第20天) 24只兔，開始造模后，分別于造模第5天、第10天、第15天、第20天隨機(jī)選取6只兔，行解剖研究；③造模中期組(即造模第21天至第40天) 24只兔，開始造模后，分別于造模第25天、第30天、第35天、第40天隨機(jī)選取6只兔，行解剖研究；④造模晚期組(即造模第41天至第60天) 24只兔，開始造模后，分別于造模第45天、第50天、第55天、第60天隨機(jī)選取6只兔，行解剖研究。

1.3.3.2 雌兔 78只雌兔分組研究方法同雄兔。

1.3.4 解剖取材 在水合氯醛兔耳緣靜脈麻醉后，以組織剪于兔肛門直腸外緣周圍分離肛門直腸，腹側(cè)分離至坐恥骨合縫下緣，左右兩側(cè)分離至坐骨緣，背側(cè)分離至尾骨與薦骨交會(huì)處。以刀全程切開坐恥骨合縫至恥骨上緣，鈍性分離直腸與髖骨、薦骨之間的組織。平行恥骨上緣切斷分離出直腸，剝離附于腸壁上的周圍組織。以刀將兔肛門直腸左右對(duì)半分離成兩部分，分別行病理與力學(xué)研究。

1.3.5 病理觀察

1.3.5.1 制片 常規(guī)取距肛緣1.5 cm的直腸組織(若發(fā)現(xiàn)常規(guī)取材處附近粘膜病變更顯著，則選取病變更顯著處制片)，通過(guò)固定、沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、染色、常規(guī)脫水、透明、封片等步驟進(jìn)行制片。

1.3.5.2 觀察分析 光學(xué)顯微鏡下觀察直腸壁粘膜層、粘膜下層、肌層、漿膜層等各層的病理改變。記錄腺體、血管、炎細(xì)胞、間質(zhì)等形態(tài)學(xué)變化情況。

1.3.6 力學(xué)分析

1.3.6.1 取材 沿直腸縱軸取一長(zhǎng)1.5 cm、寬0.5 cm的直腸組織。以特制刀片分離兔直腸為兩部分，一部分為直腸粘膜層與粘膜下層，另一部分為直腸肌層與漿膜層。取材在兔解剖當(dāng)時(shí)完成，置于生理鹽水紗布包裹，30 min內(nèi)行生物力學(xué)指標(biāo)測(cè)試。

1.3.6.2 指標(biāo)測(cè)算 在直腸粘膜層與粘膜下層縱軸中段上取a、b兩點(diǎn)，在a、b兩點(diǎn)間橫向上取c、d兩點(diǎn)。先用50倍讀數(shù)顯微鏡讀取靜止?fàn)顟B(tài)下a、b兩點(diǎn)間的長(zhǎng)度(L1，單位:mm)與c、d兩點(diǎn)的寬度(L2，單位:mm)，然后用50倍讀數(shù)顯微鏡讀取組織的厚度，將上述數(shù)據(jù)，輸入試驗(yàn)機(jī)的電腦。組織兩端固定于萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)的夾板上，往兩端行最長(zhǎng)拉伸，記錄最長(zhǎng)拉伸所用的力(P，單位:牛)、行最長(zhǎng)拉伸時(shí)粘膜的橫截面積(A，單位:mm2)、拉伸后a、b兩點(diǎn)粘膜的長(zhǎng)度(L3，單位:mm)與寬度(L4，單位:mm)，計(jì)算拉伸前后長(zhǎng)度的改變△L1(△L1= L3-L1，單位:mm)與寬度的改變△L2(△L2= L2-L4，單位:mm)。實(shí)驗(yàn)中試驗(yàn)機(jī)的電腦將實(shí)時(shí)自動(dòng)顯示應(yīng)力與應(yīng)變的關(guān)系曲線。計(jì)算公式具體如下：

①楊氏彈性模量(E,單位:MPa)：E= P/(A*△L1/L1)；

②泊松比(μ)：μ=(△L2/L2)/(△L1/L1)；

③剪切彈性模量(G,單位: MPa)：G=E/[2*(1+u)]。

1.3.6.3 計(jì)算直腸粘膜脫垂量 將測(cè)得的楊氏彈性模量、泊松比、剪切彈性模量等力學(xué)指標(biāo)輸入兔肛門直腸有限元模型中，在設(shè)定的直腸粘膜脫垂力條件下計(jì)算得出直腸粘膜852節(jié)點(diǎn)的脫垂量，前期發(fā)現(xiàn)該節(jié)點(diǎn)為粘膜脫垂相對(duì)顯著處。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS20.0軟件分析，以(mean±SD)形式表示，比較用t檢驗(yàn)和單因素方差(One-way ANOVA)分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量分析 納入兔174只，實(shí)驗(yàn)中18只死亡(9只雌兔、9只雄兔)及時(shí)補(bǔ)充，最終156只兔進(jìn)入結(jié)果分析無(wú)脫失值。

2.2 造模不同時(shí)期直腸HE染色后鏡下征象 正常兔鏡下征象見粘膜層腺體排列整齊，腺上皮細(xì)胞分化良好，粘膜下層未見血管擴(kuò)張、間質(zhì)水腫(如圖1所示)；造模早期鏡下征象見粘膜層輕度炎細(xì)胞浸潤(rùn)，粘膜下層小血管輕度擴(kuò)張、間質(zhì)疏松水腫(如圖2、3所示)；造模中期鏡下征象見粘膜層中度炎細(xì)胞浸潤(rùn)，粘膜下層血管中度擴(kuò)張、間質(zhì)疏松水腫(如圖4、5所示)；造模后期鏡下征象見粘膜層腺體增生、重度炎細(xì)胞浸潤(rùn)，粘膜下層血管重度擴(kuò)張、間質(zhì)疏松水腫(如圖6、7所示)。

2.3 力學(xué)指標(biāo) 造模不同時(shí)期直腸粘膜層與粘膜下層的楊氏彈性模量、泊松比與剪切彈性模量等力學(xué)指標(biāo)及直腸粘膜852節(jié)點(diǎn)位移量的比較，見表1～3。

分組測(cè)試時(shí)間例數(shù)/只楊氏彈性模量/Mpa泊松比剪切彈性模量/Mpa852節(jié)點(diǎn)位移量/mm雄性正常組61.5049±0.08530.4515±0.00070.5183±0.02961.3150±0.0138造模第5天61.8672±0.0718*0.4485±0.0006*0.6444±0.0249*1.3517±0.0117*造模第10天62.2646±0.1055*0.4469±0.0005*0.7826±0.0367*1.3683±0.0117*造模第15天62.6788±0.1088*0.4450±0.0006*0.9267±0.0376*1.4100±0.0141*造模第20天63.0891±0.1047*0.4432±0.0004*1.0700±0.0365*1.4450±0.0105*雌性正常組61.5088±0.0995△0.4516±0.0006△0.5197±0.0344△1.3067±0.0151△造模第5天61.8559±0.0748*△0.4486±0.0006*△0.6406±0.0260*△1.3450±0.0105*△造模第10天62.2883±0.0740*△0.4468±0.0005*△0.7908±0.0259*△1.3700±0.0126*△造模第15天62.6902±0.0837*△0.4451±0.0006*△0.9310±0.0290*△1.4033±0.0137*△造模第20天63.0860±0.0930*△0.4433±0.0005*△1.0691±0.0326*△1.4467±0.0151*△

注：與同組上一階段比較，*P<0.05；與同一階雄兔段比較，△P>0.1。

分組測(cè)試時(shí)間例數(shù)/只楊氏彈性模量/Mpa泊松比剪切彈性模量/Mpa852節(jié)點(diǎn)位移量/mm雄性造模第25天63.5314±0.08330.4421±0.00041.2243±0.02921.4750±0.0105造模第30天63.9000±0.0921*0.4411±0.0003*1.3530±0.0321*1.5117±0.0147*造模第35天64.2856±0.0701*0.4393±0.0008*1.4880±0.0245*1.5400±0.0089*造模第40天64.6877±0.0843*0.4375±0.0004*1.6339±0.0298*1.5683±0.0117*雌性造模第25天63.5147±0.10140△0.4422±0.0004△1.2186±0.0355△1.4733±0.0121△造模第30天63.8796±0.0987*△0.4410±0.0003*△1.3461±0.0344*△1.5067±0.0103*△造模第35天64.3004±0.1087*△0.4394±0.0008*△1.4943±0.0380*△1.5400±0.0167*△造模第40天64.6976±0.0706*△0.4374±0.0005*△1.6303±0.0268*△1.5633±0.0163*△

注：與同組上一階段比較，*P<0.05；與同一階雄兔段比較，△P>0.1。

注：與同組上一階段比較，*P<0.05；與同一階雄兔段比較，△P>0.1。

3 討論

中醫(yī)學(xué)最早對(duì)痔的病因記載見于《素問》，其《生氣通天論》中謂:“因而飽食，筋脈橫解，腸澼為痔”。古代醫(yī)學(xué)認(rèn)為脫肛屬“痔”病范疇，如《瘡瘍經(jīng)驗(yàn)全書》將脫肛稱“肛痔”。西醫(yī)認(rèn)為IRP屬中醫(yī)“脫肛”范疇。“筋脈橫解，腸澼為痔”認(rèn)為脫肛是經(jīng)脈因癖血積聚而懈怠、松弛、滑脫的病理改變[10]，IRP的發(fā)生與筋、脈關(guān)系密切。因此，在IRP造模不同階段，取直腸組織行微觀病理分析與宏觀生物力學(xué)有限元測(cè)試，從而研究IRP的病變過(guò)程。

有限元模型作為生物力學(xué)的一種有效研究手段，是模擬軟組織形變最經(jīng)典的方法[11]。生物力學(xué)仿真結(jié)果已被證明是準(zhǔn)確和可信的[12-13]，逐漸應(yīng)用于肛門直腸疾病的研究。它的建立需測(cè)算楊氏彈性模量、泊松比及剪切彈性模量等力學(xué)指標(biāo)。這些指標(biāo)材料性質(zhì)的物理量，標(biāo)志材料的剛性。材料的楊氏彈性模量與剪切彈性模量越大，越不容易發(fā)生形變。本研究擬運(yùn)用這些指標(biāo)研究直腸組織的剛度，分析在脫垂過(guò)程中直腸組織所發(fā)生的力學(xué)改變。

宋紅芳等[14]基于磁共振影像學(xué)資料，采用MIMICS有限元軟件重構(gòu)肛提肌的幾何結(jié)構(gòu)，應(yīng)用有限元分析方法仿真計(jì)算肛提肌的應(yīng)力分布，發(fā)現(xiàn)盆腔臟器脫垂和不同程度的壓力性尿失禁4種病理狀態(tài)下的高腹壓，可對(duì)肛提肌產(chǎn)生較大的應(yīng)力，容易造成肛提肌組織損傷。牛海軍等[15]對(duì)不同階段的兔關(guān)節(jié)炎軟骨樣本進(jìn)行病理學(xué)分級(jí)，運(yùn)用三相模型估計(jì)軟骨的軸向彈性模量，并進(jìn)行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)不同病理學(xué)關(guān)節(jié)炎等級(jí)軟骨樣本的三相力學(xué)特性有明顯差異。

本研究發(fā)現(xiàn)：在微觀病理學(xué)方面，在IRP造模不同時(shí)期，直腸粘膜層不同程度炎細(xì)胞浸潤(rùn)，粘膜下層小血管逐漸擴(kuò)張，間質(zhì)疏松水腫，該病理結(jié)果符合“筋脈橫解，腸澼為痔”理論；在宏觀生物力學(xué)有限元方面，直腸粘膜層與粘膜下層的楊氏彈性模量、剪切彈性模量在造模的中、早期逐漸增加，但在造模后期指標(biāo)逐漸降低，泊松比呈相反的變化趨勢(shì)，直腸粘膜852節(jié)點(diǎn)的位移量逐漸增加。從力學(xué)研究看，該結(jié)果與病理結(jié)果似有不相符的地方。但結(jié)合兔的生理學(xué)特征，本項(xiàng)目所研究的兔為1～3個(gè)月，相當(dāng)于人的1～10歲階段，直腸組織處于生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，所以雖然造模的中早期呈現(xiàn)炎細(xì)胞輕中度浸潤(rùn)等病理改變，但兔直腸組織的楊氏彈性模量等力學(xué)指標(biāo)仍呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。伴隨造模后期直腸粘膜層重度炎細(xì)胞浸潤(rùn)，粘膜下層血管重度擴(kuò)張等病理改變，直腸組織的楊氏彈性模量等力學(xué)指標(biāo)呈下降趨勢(shì)。

綜上，不同病理學(xué)階段的兔肛門直腸力學(xué)特性存在統(tǒng)性學(xué)差異，可能是IRP的發(fā)生機(jī)制之一。

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