沈冰冰，張 松，朱啟仁，王志榮，張卓琦*

(1.徐州醫(yī)科大學， 江蘇 徐州 221000; 2.徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 心內(nèi)科， 江蘇 徐州 221000)

隨著冠狀動脈搭橋術、經(jīng)皮冠狀動脈內(nèi)成形術等血管再通術的迅速開展，冠心病再灌注治療出現(xiàn)了一個飛躍。但心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)也成為阻礙缺血心肌從再灌注療法獲得最佳療效的主要難題，如何減輕MIRI成為醫(yī)學界新的挑戰(zhàn)[1]。據(jù)報道激活磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路可以防止神經(jīng)元凋亡和保護大腦免受缺血再灌注損傷[2]。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Akt)通過PI3K依賴通路可以促進腦缺血后細胞的存活[3]。活化的Akt可以磷酸化幾個下游靶標包括糖原合酶激酶3b(GSK3b)，該激酶在絲氨酸9(ser9)被Akt磷酸化并失活[4]。羥基紅花黃色素A(hydroxysafflor yellow A，HSYA)是從化合物紅花中分離獲得的，具有各種生物活性，包括抗氧化、抗炎性反應作用、抗血小板聚集、抗腫瘤和抗心肌損傷作用[5]。研究表明HSYA可通過抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放保護大鼠心肌細胞I/R損傷[6]。

本實驗進一步探討是否可以通過調(diào)控PI3K/Akt/GSK3β信號通路保護心肌細胞缺氧/復氧(anoxia/reoxygenation，A/R)損傷。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

清潔級新生1～3 d的SD大鼠乳鼠，雌雄不限[徐州醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證號：SCXK(蘇)2015- 0009]。HSYA(大連美侖公司，批號A1228AS,HPLC≥98%)，Ⅰ型膠原酶(Sigma公司)；高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司)；total Akt, phospho-Akt (Ser473), GSK3β 和 phospho-GSK3β(Ser9)一抗(CST)，Bax、Bcl- 2一抗(Santa Cruz公司)和兔β-actin抗體(Bioworld公司)，二抗(碧云天公司)；凋亡檢測試劑盒(南京凱基公司)；乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(南京建成公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞分離培養(yǎng)及分組處理：分離大鼠的乳鼠心肌細胞，孵育48 h，待細胞貼壁后，分為：對照組(Con組)、缺氧復氧組(A/R組)、HSYA處理組(A/R+H組)、 PI3K抑制劑(LY294002)處理組(A/R+L組)和HSYA+ LY294002處理組(A/R+H+L)。正常對照組細胞一直置于CO2培養(yǎng)箱中。A/R組行缺氧10 h，復氧2 h。HSYA加藥處理組在缺氧液中加入20 μmol/L HSYA[7]，LY294002處理組在缺氧液中加入10 μmol/L LY294002[7]。

1.2.2 細胞培養(yǎng)上清液LDH釋放量的測定：根據(jù)LDH試劑盒操作步驟進行，用酶標儀在450 nm測各組A值，帶入公式算出LDH含量(U/L)。

1.2.3 流式檢測細胞凋亡：參照細胞凋亡檢測試劑盒使用說明操作，用流式細胞儀檢測。

1.2.4 Western blot檢測Bcl- 2、Bax、 Akt和p-Akt(Ser473)、GSK3β和p-GSK3β(Ser9)的蛋白表達水平：分組處理完畢后收集各組細胞，加入細胞裂解液，收集蛋白；經(jīng)BCA法測濃度后，行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS．PAGE)，按半干轉(zhuǎn)方法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉后，加入一抗4 ℃孵育過夜，洗膜后二抗室溫孵育1 h，再洗膜后，顯色。用Image J圖像分析蛋白條帶。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 HSYA可降低各組的LDH釋放量

與對照組比較，A/R后LDH的釋放量增加(P<0.001)，與A/R組比較，A/R+H組LDH釋放量降低(P<0.001)，與A/R+H組比較， A/R+L組、A/R+H+L組LDH釋放量增加(P<0.001)(圖 1)。

*P<0.001 compared with the Con group；#P<0.001 compared with the A/R group； ΔP<0.001 compared with the A/R+H group圖1 原代心肌細胞LDH釋放量的改變Fig 1 Change in the LDH release of primary cardiomy-

2.2 HSYA處理可降低A/R后心肌細胞的凋亡率

與對照組比較，A/R后細胞的凋亡率增加(P<0.001)；與A/R組比較，A/R+H組凋亡率降低(P<0.001)，與A/R+H組比較，A/R+L組、A/R+H+L組細胞凋亡率增加(P<0.001)(圖2)。

2.3 Western blot檢測Bcl- 2、Bax、 Akt、p-Akt(Ser473)、GSK3β和p-GSK3β(Ser9)的蛋白表達水平

2.3.1 A/R后各實驗組凋亡相關蛋白表達水平的比較：與對照組相比，A/R后促凋亡蛋白Bax表達增加(P<0.001)，而抗凋亡蛋白Bcl- 2表達減少(P<0.001)；與A/R組相比，A/R+H組Bax蛋白表達減少(P<0.001)，而Bcl- 2蛋白表達增加(P<0.001)；與A/R+H組比較，A/R+H+L組Bax蛋白表達增加(P<0.001)，而Bcl- 2蛋白表達明顯減少(P<0.001)(圖3，4)。

2.3.2 A/R后各實驗組Akt和p-Akt(Ser473)、GSK3β和p-GSK3β(Ser9)蛋白表達水平的比較:與對照組相比，A/R后p-Akt(Ser473)、p-GSK3β(Ser9)蛋白表達減少(P<0.001)；與A/R組相比，A/R+H組p-Akt(Ser473)、p-GSK3β(Ser9)蛋白表達增加(P<0.001)；與A/R+H組比較，A/R+H+L組p-Akt(Ser473)、p-GSK3β(Ser9)蛋白表達降低(P<0.001)(圖5，6)。

3 討論

心血管疾病是全世界死亡的主要原因，并且仍然是現(xiàn)代社會的主要殺手之一。它可以由多種因素啟動，包括缺血/再灌注損傷。細胞凋亡是細胞死亡的生理過程，在各種生物系統(tǒng)中發(fā)揮關鍵作用，這一直是被認為為缺血/再灌注損傷的啟動和進展提供了重要的分子基礎[8]。紅花黃色素是從紅花的花瓣中提取出的天然黃色素，為查耳酮類化合物。研究發(fā)現(xiàn)紅花黃色素具有擴張冠狀動脈、改善心肌缺血、抑制血栓形成、抑制細胞凋亡、抗氧化、抗感染和腦保護[9]等多種藥理功能。HSYA是紅花黃色素的主要成分，研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠中，HSYA可通過PI3K/Akt/GSK3β信號通路發(fā)揮抗凋亡作用來保護腦缺血再灌注損傷[10]。但PI3K/Akt/GSK3β信號通路在心肌細胞中的具體作用機制，目前尚無報道，本實驗通過培養(yǎng)原代心肌細胞模擬MIRI損傷來研究該通路在心肌細胞中的作用機制。實驗中通過檢測各組細胞的上清液的LDH的釋放量和各組細胞的凋亡率，結(jié)果顯示A/R后LDH釋放量和凋亡率增加，而加用HSYA處理后，LDH和凋亡率降低，而加入PI3K的抑制劑LY294002后這種作用消失，表明HSYA可減少心肌細胞的凋亡，而這種保護作用可能是通過PI3K這條途徑發(fā)揮作用的。

*P<0.001 compared with the Con group；#P<0.001 compared with the A/R group； ΔP<0.001 compared with the A/R+H group

*P<0.001 compared with the Con group；#P<0.001 compared with the A/R group；ΔP<0.001 compared with the A/R+H group圖3 各組凋亡蛋白Bax表達水平的比較Fig 3 Comparision of the protein expression of

*P<0.001 compared with the Con group；#P<0.001 compared with the A/R group；ΔP<0.001 compared with the A/R+H group圖4 各組凋亡蛋白Bcl- 2表達水平的比較Fig 4 Comparision of the protein expression of

*P<0.001 compared with the Con group；#P<0.001 compared with the A/R group；ΔP<0.001compared with the A/R+H group

*P<0.001 compared with the Con group；#P<0.001 compared with the A/R group；ΔP<0.001compared with the A/R+H group

本實驗結(jié)果顯示A/R后促凋亡蛋白Bax表達增多，而抗凋亡蛋白Bcl- 2表達減少；HSYA處理后，可減少促凋亡蛋白表達，增加抗凋亡蛋白表達；而加入抑制劑LY294002后， HSYA的抗凋亡作用消失，表明HSYA可減少心肌細胞的凋亡，并且是通過激活PI3K這條通路發(fā)揮作用的。

PI3K/Akt是細胞內(nèi)重要的信號傳導通路之一,其在細胞的凋亡、存活、增殖以及細胞骨架的變化等中發(fā)揮著重要的生物學功能。PI3K下游有多種效應分子，Akt 處在這一通路的中心環(huán)節(jié)，是 PI3K 直接靶點和最主要的靶酶。只有磷酸化的 Akt才能發(fā)揮抗凋亡蛋白合成及促細胞生存等功能[11]。一項研究顯示在HSYA誘導的腦缺血再灌注損傷抗凋亡作用中，GSK3β是PI3K/Akt信號通路的一個重要的下游因子[10]。本實驗Western blot檢測表明， A/R后Akt(Ser473)、p-GSK3β(Ser9)蛋白表達明顯減少；而經(jīng)HSYA處理后，p-Akt(Ser473)、p-GSK3β(Ser9)蛋白表達增加，加入抑制劑LY294002后該作用消失，證實HSYA的這種保護作用可能是通過激活PI3K/Akt/GSK3β這條通路發(fā)揮的。

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