陳小燕，樊夢雅，李 慧，蔣易楠，靖 靜，張海龍*

(1. 河南大學 醫(yī)學院 抗體藥物開發(fā)技術國家地方聯(lián)合工程實驗室 河南省抗體藥物國際聯(lián)合實驗室細胞與分子免疫重點實驗室，河南 開封 475004； 2.鄭州大學 基礎醫(yī)學院， 河南 鄭州 450001)

心肌微血管是深入心臟內的終末細小分支，在心臟內分布廣泛，結構上與其他血管不同，由單層內皮細胞和細胞外基質組成；微血管內皮細胞在表型與功能上均表現(xiàn)出不同于大血管內皮細胞的異質性，且其性質與功能在不同組織器官之間也具有顯著差異[1]。

研究表明，心肌微血管內皮細胞(cardiac microvascular endothelial cell，CMEC)在心臟生理與病理過程(如急性缺血損傷、心肌肥大等)中起著非常重要的作用[2]，是許多心血管疾病或危險因素作用的靶器官[3- 4]。低氧、炎性反應和血栓等均是以微血管內皮細胞受損及功能紊亂為始發(fā)因素[5- 7]而發(fā)生的。近年來，由于對心血管疾病研究的深入，心肌微血管內皮細胞的分離純化成為熱點。但由于培養(yǎng)難度大，純化復雜，培養(yǎng)基條件要求高等原因，使得原代細胞的分離難以實現(xiàn)。本研究結合國內外原代細胞培養(yǎng)技術，進行學習和改進，成功分離培養(yǎng)出成年大鼠心肌微血管內皮細胞，為心血管疾病的體外研究提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SPF級Wistar雄性大鼠[北京維通利華實驗技術有限公司，合格證書編號：SCXK(京)2012- 0001]，7～8周齡。飼養(yǎng)于河南大學實驗動物中心，所有的動物飼養(yǎng)和實驗操作均嚴格按照本校動物管理委員會要求執(zhí)行。

1.1.2 主要試劑：戊巴比妥鈉和磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS，索萊寶)；D-Hanks緩沖液、鼠尾膠原、Ⅱ型膠原酶、胰島素、轉鐵蛋白和亞硒酸鈉(Sigma 公司)；胰蛋白酶、DMEM、M199培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco公司)；內皮細胞生長因子(Novoprotein公司)；第Ⅷ因子相關抗原兔抗體(Novusbio公司)；抗大鼠CD31單克隆抗體(Abcam公司)；兔IgG-SABC試劑盒(博士德公司)；鼠Alexa Fluor 594-IgG抗體(Molecular Probes公司)。

1.2 方法

1.2.1 酶消化法分離成年大鼠心肌微血管內皮細胞(CMEC)：按0.2 mL/100 g質量，用 2%戊巴比妥鈉腹腔注入麻醉大鼠，固定在手術臺上，75%乙醇對大鼠進行消毒滅菌，逐層剪開胸腔，取出心臟，在預冷的PBS中清洗心臟2～3次。然后將心臟置于離體心臟灌流裝置上，用預先預冷和充氧的灌流緩沖液CFS (mmol/L：NaCl 134，葡萄糖11，KCl 4，MgSO41.2，Na2HPO41.2，HEPES 10，pH 7.35)沖洗心臟約3～5 min。將心臟取下置于無鈣的D-Hanks液中(在冰上操作)，于超凈工作臺中剪去多余的血管組織、左右心房、右心室及室間隔，將左心室置于75%乙醇中30 s，用鑷子將心室的心內外膜剝掉，將組織切成約1 mm3大小的碎塊，轉移到250 mL錐形瓶中，先用D-Hanks緩沖液清洗1次，隨后加入2% Ⅱ型膠原酶于37 ℃ 110 r/min的水浴鍋中振蕩消化20 min，接著加入等體積0.1%胰蛋白酶，以同樣的條件消化20 min，將上清液用70 μm網篩過濾，1 000 r/min離心10 min，重復洗滌細胞1次；然后用完全培養(yǎng)基(20% FBS，2 ng/mL VEGF，870 nmol/L胰島素，65 nmol/L轉鐵蛋白，29 nmol/L亞硒酸鈉，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素，DMEM∶M199為1∶1)重懸并進行細胞計數(shù)，接種于包被有100 μg/mL鼠尾膠原的細胞培養(yǎng)皿中，將細胞置于37 ℃ 5% CO2的培養(yǎng)箱中，待培養(yǎng)6 h后更換新鮮培養(yǎng)基，之后每2 d進行換液。待細胞增殖至80%匯合度時進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 大鼠心肌微血管內皮細胞(CMEC)鑒定

1.2.2.1 細胞形態(tài)觀察：在顯微鏡下觀察并記錄原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)的CMEC形態(tài)及增殖特征。

1.2.2.2 細胞增殖曲線繪制：取第3代CMEC進行消化傳代，細胞以2.5×104個/孔接種于12孔板中，共接種21個孔，每24 h計數(shù)1次，每次3個孔；取20 μL 細胞懸液與等體積的0.2%錐蟲藍染液混合后，取20 μL滴入細胞計數(shù)板中，計算活細胞數(shù)，繪制增殖曲線。

1.2.2.3 CMEC的分子標志第Ⅷ因子相關抗原和CD31的鑒定：第Ⅷ因子相關抗原免疫細胞化學鑒定：CMEC接種到加有細胞爬片的12孔板中，接種量為2×105個/孔；在37 ℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。取出細胞爬片，PBS洗滌3次，每次5 min；4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS洗滌3次，每次5 min；0.1% Triton-X 100于4 ℃處理10 min，30 mmol/L甘氨酸室溫孵育3 min，PBS洗滌3次，每次5 min；然后用3% BSA室溫封閉1 h；抗第Ⅷ因子相關抗原抗體(1∶50)4 ℃孵育過夜。兔IgG-SABC試劑盒進行染色；蘇木精染核后，中性樹膠封片；顯微鏡進行觀察拍照。

CD31免疫熒光鑒定：操作如上所述，只是不用0.1% Triton-X 100處理；抗CD31抗體(1∶50)4 ℃孵育過夜；PBS洗滌3次，每次5 min；然后用Alexa Fluor 594標記的羊抗鼠IgG室溫避光孵育1 h，PBS洗滌3次，每次5 min；DAPI染細胞核之后，倒置熒光顯微鏡進行觀察拍照。

1.2.2.4 體外血管形成實驗：前1 d，將Matrigel matrix置于4 ℃過夜溶解，實驗前2 h將槍頭、EP管、細胞培養(yǎng)板等置于4 ℃預冷。取150 μL Matrigel matrix置于24孔板中，鋪勻后于37 ℃放置30 min。取第3代細胞進行消化處理，2.5×105個/孔接種于含有Matrigel matrix的培養(yǎng)板中，在37 ℃ 5% CO2條件下進行培養(yǎng)，然后倒置顯微鏡觀察拍照。

2 結果

2.1 CMEC形態(tài)特征

經倒置顯微鏡觀察，原代分離的成年大鼠心肌微血管內皮細胞呈圓形懸浮于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h即貼壁增殖，3～4 d后增殖至90%左右匯合(圖1A)。當培養(yǎng)密度較低時細胞形成星形或多邊形，細胞增殖到90%匯合度時呈鋪路石樣增殖(圖1B)。

2.2 細胞增殖曲線

CMEC的增殖曲線如圖2所示。在5次分離實驗中，選取其中一次分離結果進行增殖曲線繪制。結果顯示，前4 d細胞增殖迅速，呈對數(shù)期增殖，第4天之后細胞處于穩(wěn)定狀態(tài)，不再迅速增殖。

A.primary passage； B.second generation of cell culture圖1 CMEC形態(tài)觀測Fig 1 Morphological observation of CMEC(×100)

圖2 CMEC增殖曲線Fig 2 Proliferation curve of

2.3 CMEC的分子標志

第Ⅷ因子相關抗原免疫細胞化學結果(圖3A)顯示，95%以上的細胞胞質呈棕色，細胞核呈藍紫色；CD31免疫熒光結果(圖3B)顯示，細胞胞質和核膜周圍有紅色熒光，細胞核呈藍色熒光。表明分離出的細胞具有內皮細胞的特征。

2.4 體外血管形成實驗

CMEC的體外血管形成實驗結果(圖4)顯示，細胞包被在有基質膠的24孔板上，培養(yǎng)2 h即可貼壁、黏附，形成分散的網狀及管腔結構(圖4A)，4 h時管腔結構更加明顯，且結構完整，具有內皮細胞的典型特點(圖4B)。

A.Factor Ⅷ; B.CD31圖3 CMEC的分子標志Fig 3 Molecular markers of CMEC(×200)

A.2 hours; B.4 hours圖4 CMEC的體外血管形成Fig 4 Angiopoiesis of CMEC plated on matrigel(×100)

3 討論

在以往的研究中，CMEC常用的分離方法有酶消化法和組織貼塊法[1,5]等，但是研究中發(fā)現(xiàn)，單純的酶消化法分離的細胞，由于消化時間過長，對細胞的損傷則會加大；而使用組織貼塊法則不能很好的排除成纖維細胞及心肌細胞等的污染。因此，本實驗在相關研究[5]之后，結合實驗室現(xiàn)有條件，對CMEC的分離及培養(yǎng)上，進行了以下幾個方面的改進：1)將取出的心臟先用灌流裝置進行灌洗，以充分去除血管內的血細胞，使得微血管內沒有凝結的血塊；于冰上迅速將組織切成1 mm3大小的碎塊，減少酶的消化時間，降低細胞因過度消化而造成的損傷；2)將左心室置于75%乙醇中浸泡30 s，然后用鑷子完全剝離心內外膜，最大程度上的降低其他細胞及細菌的污染；3)選擇合適的培養(yǎng)基：為了滿足CMEC所需要的營養(yǎng)物質及增殖條件，本實驗采用20% FBS，添加適量的胰島素、轉鐵蛋白和亞硒酸鈉，同時加入VEGF，不僅滿足CMEC的增殖需求，一定程度上起到了抑制成纖維細胞的作用[8]；4)在對包被液的選擇上，嘗試了多種試劑，如多聚-L-賴氨酸、鼠尾膠原和明膠等，發(fā)現(xiàn)CMEC在100 μg/mL鼠尾膠原包被的培養(yǎng)皿中貼壁較快，因此實驗中選取該濃度進行包被。結果顯示，CMEC呈鋪路石樣增殖，且可形成管腔樣結構，具有內皮細胞的典型特點[6]；表面標志物鑒定結果表明，CMEC的第Ⅷ因子相關抗原和CD31結果呈陽性[8- 10]；在體外血管形成實驗中[11]，血管形成完好，管腔結構完整，綜上結果可證明其為心肌微血管內皮細胞。

血管內皮細胞位于血管內壁，細胞間排列緊密形成一層薄膜，為血液的流通提供“管道”，起著物質交換及屏障的作用[12]。有報道在心肌缺血再灌注損傷中，CMEC損傷早于心肌細胞[13]。因此，體外分離培養(yǎng)心肌微血管內皮細胞對進一步研究探討心臟微環(huán)境的生理及病理改變是至關重要的。

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新聞點擊

降低心力衰竭風險的3個關鍵

據(jù)美國WebMD醫(yī)學新聞網(2016- 12- 07)報道，一項新研究顯示，中年人避免肥胖、高血壓以及糖尿病在晚年較不容易患心力衰竭。

調查人員發(fā)現(xiàn)，與沒有管理體質量、血壓以及血糖的人相比，45歲沒有這3種關鍵性風險因子的人心力衰竭風險降低86%。

西北大學Feinberg醫(yī)學院的John Wilkins博士認為，良好的生活習慣有助于避免許多人的肥胖、高血壓以及糖尿病風險，這會大幅降低他們晚年發(fā)生心血管疾病的概率。

另一位心臟專家Gregg Fonarow博士認為，這提示應該做對于維持健康體質量必要的事情，包括吃有益心臟的飲食、保持運動、固定監(jiān)控以確保健康的血壓與血糖值等。

在這3個心力衰竭的風險因素中，糖尿病似乎有最強的效果，與45歲時有糖尿病的人相比，沒有糖尿病的人9～11年一般不會發(fā)生心力衰竭。

研究人員認為，我們需要對飲食習慣以及運動方面做更多的改變。大多數(shù)人仍然缺乏支持健康的關鍵食物，如水果、蔬菜、全谷類等幾乎都沒有達到建議量。

這篇研究結果刊登在2016-11-28《JACC：心力衰竭》在線版。